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胃癌是全球常见的消化道恶性肿瘤之一,近年来的发病率呈上升趋势,每年约有9百万人被确诊为胃癌,其中东欧、南美及东亚发病率最高。目前胃癌的治疗方案是以手术切除为主的综合治疗,化学治疗是其重要的辅助治疗手段,但大多数胃癌患者在治疗后容易复发,为了有效防止复发,我们试图寻找一些更有效的、更新机制的医疗手段。那可丁(Noscapine,简称Nos),是一种来自罂粟属鸦片的邻苯二甲酸异喹啉生物碱,在鸦片的生物碱含量中占1%-10%,分子式C22H2307N,相对分子量为413。在过去的75年里,那可丁通常是作为一种没有明显毒副作用的止咳药使用。那可丁的化学结构与已知的微管抑制剂秋水仙碱很相似,其抑制微管的作用已被广泛的认可。目前,那可丁作为一种治疗慢性淋巴细胞性白血病和霍奇金淋巴瘤的药物,已进入Ⅰ、Ⅱ期临床试验阶段。那可丁结合微管蛋白促进微管聚合,从而诱导细胞生长停滞。而且,有报道证实那可丁可通过线粒体途径诱导部分肿瘤细胞调亡。但是,目前尚无文献研究那可丁对胃癌细胞的抗肿瘤作用。本实验提出一个假设：那可丁是否在抗胃癌细胞中扮演重要角色?以及通过何种途径?为了验证这个假设,本研究第一部分体外实验,用不同浓度的那可丁干预胃癌BGC823细胞,观察肿瘤细胞的活力变化和凋亡情况,并初步探讨其发生机制。第二部分体内实验,通过将胃癌BGC823细胞注射在裸鼠皮下,建立人胃癌皮下移植瘤模型,观察不同浓度的那可丁对肿瘤的抑制作用,并初步探讨其发生机制。第三部分在前两部分的基础上,通过RNA干扰构建慢病毒载体并下调CDH17基因,观察CDH17基因联合那可丁对肿瘤的抑制作用。综合整个实验结果,表明低浓度的那可丁即可抑制胃癌BGC823细胞的生长,呈量效关系,凋亡的线粒体通路可能参与其中,并且CHD17基因可以增强那可丁对人胃癌BGC823细胞的杀伤作用,同样,凋亡的线粒体通路可能参与其中,为临床上治疗胃癌找到了一条新的潜在途径。材料和方法1.浓度10μM的那可丁,分别干预四种胃癌细胞(BGC823、SGC7901、MGC803、HGC27)12、24及36 h后,MTT法检测细胞生存率变化,初步筛查敏感细胞。浓度分别为10、100和150μM的那可丁,干预胃癌BGC823细胞12、24及36 h后,MTT法检测细胞生长抑制率变化。不同浓度的那可丁干预胃癌BGC823细胞24 h后,Hoechst33258染色法及流式Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡情况；Western blotting方法检测procaspase-3和procaspase-9及其激活片段cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表达水平的变化。2.将人胃癌BGC823细胞(5×106,重悬于100μLPBS溶液中)接种于裸鼠右侧背部皮下。当肿瘤体积达100-150 mm3后,那可丁(10mg/kg、20mg/kg、40 mg/kg)每隔3d行瘤内注射,并用游标卡尺测量瘤体长径和宽径,接种后33 d处死裸鼠。观察裸鼠状态和移植瘤的生长状况,绘制生长曲线、称量瘤重、组织病理学观察瘤体形态结构变化及TUNEL方法检测细胞凋亡情况。3.通过构建CDH17-miRNA慢病毒表达载体,下调CDH17基因。设计4条miRNA序列转入CDH17基因。设一个阴性对照组(Lenti-CDH 17-miR-neg)。利用基因转染技术将重组载体转入BGC823细胞(Lenti-CDH 17-miR-B), RT-PCR和Western blotting方法检测BGC823、Lenti-CDH 17-miR-neg和Lenti-CDH 17-miR-B的表达,确定载体是否构建成功。通过Hoechst33258染色法及流式Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡情况；Western blotting方法检测Bcl-2和Bax的表达水平的变化。建立移植瘤模型观察裸鼠状态和移植瘤的生长状况,绘制生长曲线、称量瘤重、组织病理学观察瘤体形态结构变化及TUNEL方法检测细胞凋亡情况。结果1.那可丁(10μM)干预BGC823、SGC7901、MGC803、HGC27细胞12、24、36h后发现那可丁对BGC823细胞抑制率要明显高于SGC7901、MGC803和HGC27细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。浓度为10μM的那可丁干预GBC823细胞12、24及36h后,细胞抑制率分别为(10.26±2.10)%、(21.71±3.51)%及(76.34±6.25)%,并且随着浓度的增加(100和150μM)其抑制作用随之增加(P<0.05)。Hoechst 33258染色法及流式Annexin V-FITC/PI法结果表明那可丁诱导胃癌细胞凋亡且呈量效关系,差异有统计学意义(P<0.05)。以上结果表明那可丁具有杀伤人胃癌细胞的作用。Western blotting法检测结果表明,随着浓度的升高(50、100、150μM),Bcl-2表达明显减弱,而Bax、Cyt-c、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9表达明显增强。以上结果表明线粒体通路可能参与了那可丁诱导人胃癌BGC823细胞凋亡的过程。2.不同浓度那可丁干预后,细胞皮下移植瘤生长速度较慢、体积较小,呈量效关系,差异有统计学意义(P<0.05)。瘤体TUNEL检测结果显示,随着药物浓度的增加凋亡细胞明显增多,差异有统计学意义(P<0.05)。3. RT-PCR和Western blotting方法检测证实Lenti-CDH 17-miR-B组的CDH17mRNA和蛋白表达与BGC823组和Lenti-CDH 17-miR-neg组相比明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。而BGC823组和Lenti-CDH 17-miR-neg组之间CDH17表达没有差异(P>0.05)。行体内、外实验后证实那可丁联合下调CDH17基因治疗效果更优于单纯使用那可丁治疗(P<0.05)。结论在体外实验中,那可丁具有杀伤人胃癌BGC823细胞的作用并呈量效关系,线粒体通路可能参与了凋亡过程。在体内实验中,那可丁可以更有效的以凋亡方式抑制人胃癌裸鼠皮下移植瘤的生长,并呈量效关系。下调CDH17基因可以增强那可丁杀伤人胃癌BGC823细胞的作用。基于以上研究结果,我们为临床上治疗胃癌找到了一条新的潜在途径。