实体器官移植是能够治疗诸多终末期器官衰竭的治疗策略。例如,肝移植是治疗终末期肝病如肝癌以及肝衰竭的最佳选择。目前移植后机体出现的排斥反应仍然是制约移植疗效的主要原因。实体器官移植后的生存率受到慢性排斥反应以及需要终身使用免疫抑制剂及其相关毒性的限制。例如肝脏移植后,受体总会或多或少的发生免疫应答反应,并引起一系列的并发症,这对患者的健康带来的一定威胁。而器官移植急性排斥反应是影响器官移植术后患者生存的重要因素,是目前研究的热点和难点。归根到底是急性排斥反应机制尚有待进一步阐明。为了改善患者进行器官移植后出现的排斥反应现象,市场上出现了很多免疫抑制剂,这些免疫抑制剂需要长期甚至终身服用,这样的情况会给患者带来极大的负担。因此,一些临床前和临床研究已经开始探索诱导移植免疫耐受从而不需终身服用免疫抑制剂的方法。树突状细胞（dendritic cells,DC）是专职抗原递呈细胞（APCs）,以启动免疫系统的能力而闻名,但一些研究表明,它们可以促进同种异体抗原的耐受性。无论髓系还是浆细胞样树突状细胞（pDC）都可以参与对同种异体抗原的耐受性。更有研究表明DC细胞的功能与其成熟度相关,成熟的DC能够激活免疫应答,但未成熟的DC更易诱导对同种异体的耐受性。因此,维持DC在体内的未成熟状态对诱导耐受功能至关重要。既往研究表明,在DC成熟的过程中有诸多miRNA表达异常,miR-let-7i便在此过程中表达上调。既往对于miR-let-7i对DC细胞的影响研究多是体外研究与肿瘤免疫研究,而在体内研究miR-let-7i对DC的成熟度及功能的影响以及其对动物同种异体器官移植诱导机体产生免疫耐受具有创新性。在此前的研究中,维持DC未成熟状态在啮齿类动物模型上已经取的了良好的效果但其在灵长类动物模型上却很难诱导出同样理想的效果。因此本课题以恒河猴为研究对象,恒河猴的免疫系统与人高度相似。在非人灵长类动物上诱导具有靶向性的持久免疫耐受将具有重要的理论意义及临床应用前景。本研究以非人灵长类动物恒河猴作为试验动物,构造恒河猴同种异体皮肤移植模型,研究抑制DC细胞miR-let-7i诱导恒河猴皮肤免疫耐受过程中发挥的作用和机制,具有理论价值和创新性。[目 的]1.分离恒河猴外周血中的树突状细胞（dendritic cells,DC）,并进行诱导培养、鉴定;将DC细胞与T淋巴细胞混合培养,探究不同状态DC细胞功能及对T细胞的影响。2.探究miR-let-7i在DC未成熟状态及功能中的作用。3.探究miR-let-7i促进DC维持未成熟状态及免疫耐受功能的分子机制。4.建立动物模型探究miR-let-7i对恒河猴皮肤移植免疫耐受的影响。[方 法]1.使用单核细胞分离液分离恒河猴外周血并收集CD34+细胞;2.使用粒细胞-巨噬细胞集落因子（GM-CSF）、白细胞介素（interleukin,IL）-4诱导培养未成熟DC（imDC）细胞;TNF-α诱导培养成熟DC（mDC）;3.镜下观察细胞形态;4.流式细胞仪进行细胞的表型鉴定以及检测DC成熟标志物表达;5.CCK-8检测混合培养T淋巴细胞的增殖情况;6.流式细胞术检测T细胞凋亡情况;7.酶联免疫吸附（ELISA）检测上清液中IL-2、IL-4、IL-10及IFN-γ表达;8.构建过表达/低表达miRNAlet-7i载体（人工合成模拟物mimic/抑制物inhibitor脂质体转染）并行转染效率检测;9.实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测miR-let-7i表达;10.流式细胞术行基因转染后细胞表型鉴定;11.CCK-8检测基因转染后T细胞增殖情况;12.流式细胞仪检测基因转染后T细胞凋亡情况;13.ELISA检测上清液中基因转染后IL-2、IL-4、IL-10及IFN-γ表达;14.流式细胞仪检测基因转染后CD4+CD25+Treg细胞比例;15.生物信息学网站（StarBase）预测miR-let-7i与CCR7结合位点;16.双荧光素酶报告基因验证miR-let-7i与CCR7的靶向关系;17.蛋白印迹法（Western Blot）验证miR-let-7i与CCR7的调控关系以及相关蛋白表达;18.CCK-8检测miRNAlet-7i与CCR7不同处理因素下对T细胞的增殖活力的影响;19.流式细胞仪检测miRNAlet-7i与CCR7不同处理因素下对T细胞凋亡的影响;20.流式细胞仪检测miRNAlet-7i与CCR7不同处理因素下对CD4+CD25+Treg细胞分化的影响;21.ELISA检测miRNAlet-7i与CCR7不同处理因素下细胞中炎性因子IL-2、IL-4、IL-10及IFN-γ表达的影响;22.构建恒河猴同种异体皮肤移植模型;23.研究探讨抑制树突状细胞miRNAlet-7i信号对恒河猴同种异体皮肤移植术后皮片排斥的影响。[结 果]1.分离得到的CD34+细胞在第5天成功诱导出imDC,镜下观察细胞表面光滑,凹凸不平,毛刺突起少;培养至第7天,mDC被成功诱导,镜下观察细胞表面有很多树枝状突起,其长度不一,形态不同。2.经实时荧光定量PCR检测发现,TNF-α诱导DC成熟的过程中miR-let-7i表达升高（P＜0.01）;将 miR-let-7i mimic 与 miR-let-7i inhibitor 转染至细胞中,miR-let-7i 表达升高与显著降低,说明转染成功,转染效果较好,并且本实验所采用的试剂能够有效调控miRNA-let-7i的表达水平。3.流式检测DC表面成熟标志物表达,使用LPS诱导DC后,CD80、CD86、MHC Ⅱ阳性率为25.1%、20.6%、36.8%,与imDC细胞相比显著升高。而将miR-let-7i mimic转染至细胞中其促进LPS诱导的作用,CD80、CD86、MHC Ⅱ阳性率97.6%、91.9%、96.6%,与NC-mimic+LPS组相比具有显著差异性,但是将miR-let-7i过表达的同时将CCR7也同时过表达,miR-let-7i高表达的作用被显著逆转;而将miR-let-7i表达抑制后,CD80、CD86、MHC Ⅱ 阳性率为:40.9%、41.3%、41.7%,LPS诱导的作用被明显逆转且具有显著差异性,在降低miR-let-7i同时也将CCR7表达降低后,CD80、CD86、MHC Ⅱ阳性率再次升高。在LPS诱导后将CCR7单独过表达,显著抑制LPS诱导的作用,而加入Toll样受体信号通路激动剂后,部分逆转过表达CCR7的作用;将CCR7表达降低,明显促进LPS诱导的作用,但加入Toll样受体通路抑制剂后,部分逆转低表达CCR7的作用。4.CCK-8检测发现mDC能够显著促进T细胞的增殖活力,当二者比例达到1:20时,T细胞增殖最快且约是imDC的1.84倍。将miR-let-7i mimic单独转染至细胞中后,明显促进T细胞增殖（OD值从1.24上升至1.71）,而将OE-CCR7与其共同转染则明显回复单独转染miR-let-7i mimic的作用。将miR-let-7i inhibitor转染至细胞中后,T细胞的增殖被显著抑制（OD值从1.31降至1.02）,低表达miR-let-7i的同时将CCR7表达敲低,显著逆转单独转染miR-let-7i的作用。而单独将CCR7过表达后,明显抑制T淋巴细胞的增殖（OD值从1.29降至0.61）,而加入Toll样受体信号通路激动剂后显著回复单独过表达CCR7的作用。单独将CCR7表达抑制,明显促进T细胞增殖（OD值从1.30降至1.43）,而加入Toll样受体信号通路抑制剂后,逆转单独低表达CCR7的作用。5.流式细胞术检测T细胞凋亡情况,LPS诱导DC成熟的过程中,T细胞的凋亡被显著抑制。而将miR-let-7i mimic单独转染至细胞中,T淋巴细胞的凋亡再次被抑制;此时将CCR7的表达同样升高后,T淋巴细胞的凋亡被促进。将miR-let-7i inhibitor转染至细胞中,明显逆转LPS诱导的作用,促进T细胞凋亡;与此同时,将CCR7的表达降低后,抑制miR-let-7i低表达的作用。当单独将CCR7的表达升高,促进T淋巴细胞的凋亡,加入Toll信号通路激动剂后,逆转过表达CCR7的作用。单独将CCR7的表达抑制后T细胞凋亡被抑制,而加入Toll信号通路抑制剂后,部分逆转低表达CCR7的作用。6.LPS 诱导后,IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ表达量分别为 164.31±7.73、82.21±2.84、128.80±7.61、195.48±5.14 pg/mL,与 imDC 组相比显著升高。而将 miR-let-7i mimic 转染至细胞中,IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10表达量分别为206.54±4.15、244.85±3.37、54.06±5.68、60.82±4.97 pg/mL,明显促进 LPS 的作用。将miR-let-7i mimic 与 OE-CCR7共同转染 IL-2、IL-4、IFN-γ、IL-10 表达量分别为 72.66±4.15、126.11±0.23、120.96±0.49、75.71±4.72 pg/mL,明显回复单独转染miR-let-7i mimic的作用。而将miR-let-7i inhibitor转染至细胞中,IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10 表达量分别为 92.49±4.66、150.54±5.92、106.94±4.67、122.61±4.78 pg/mL,而同时将si-CCR7转染至细胞中,明显逆转单独转染miR-let-7i inhibitor的作用。单独转染OE-CCR7,使得IL-2及IFN-γ表达下调,IL-10、IL-4表达显著上调,而加入Toll信号通路激动剂后明显逆转单独转染OE-CCR7的作用;单独转染si-CCR7,IL-2及IFN-γ表达上调,IL-10、IL-4表达显著下调,加入Toll通路抑制剂,部分逆转单独转染si-CCR7的作用。7.流式细胞仪检测CD4+CD25+Treg细胞分化,加入LPS诱导,结果表明,mDC抑制CD4+CD25+Treg分化平均仅有20.3%。将miR-let-7i mimic单独转染,其促进LPS诱导的作用,CD4+CD25+Treg再次被抑制,其平均19.3%;而将CCR7与其共同高表达,miR-let-7i mimic作用被抑制。将miR-let-7i inhibitor转染,抑制LPS的作用,CD4+CD25+Treg数量平均为33%,其数量明显增加;而将CCR7与其共抑制,则逆转单独转染miR-let-7i inhibitor作用。单独的将CCR7过表达,CD4+CD25+Treg被抑制,加入Toll通路激动剂后,其作用被逆转;将CCR7单独低表达,促进CD4+CD25+Treg分化,但加入Toll通路抑制剂后,其作用被逆转。8.经StarBase查询,miR-let-7i和CCR7之间存在结合序列,将双荧光素酶报告基因验证后,miR-let-7i mimic能够显著抑制CCR7-WT（CCR7野生型）荧光素酶活性,而对CCR7-MUT（CCR7突变型）无显著影响,结果表明二者间存在调控关系。9.经 Western Blot 检测,与 imDC 相比,mDC 显著降低 CCR7 表达（0.78±0.16vs.0.52±0.15）。过表达 miR-let-7i,下调 CCR7 表达（0.77±0.04 降至 0.50±0.07）;抑制miR-let-7i,CCR7 上调（0.81±0.01 升至 1.15±0.15）。LPS 诱导后,TLR4（0.45±0.05升至1.01±0.10）、MyD88（0.41±0.01 升至 0.76±0.05）、NF-kB p65（0.75±0.03 升至1.09±0.06）、STAT1（0.65±0.16 升至 1.09±0.13）;而将 CCR7 过表达后,TLR4（1.01±0.10降至 0.77±0.11）、MyD88（0.76±0.05 降至 0.65±0.07）、NF-kB p65（1.09±0.06 降至0.67±0.02）、STAT1（1.09±0.13 降至 0.74±0.02）抑制 LPS 诱导作用;加入 Toll 通路激动剂,明显回复OE-CCR7作用。将CCR7低表达,TLR4（0.77±0.11升至0.83±0.05）、MyD88（0.65±0.07 升至 0.95±0.11）、NF-kB（0.67±0.02 升至 0.93±0.04）、STAT1（0.74±0.02升至0.87±0.05）进一步促进LPS诱导效果,加入Toll通路抑制剂后,逆转该作用。LPS诱导导致MHCⅡ、CD80、CD86表达升高,OE-CCR7逆转该作用,加入Toll通路激动剂回复OE-CCR7的作用;si-CCR7促进LPS作用,加入Toll通路抑制剂,逆转si-CCR7作用。10.通过建立恒河猴同种异体皮肤移植模型,皮肤移植术后特定时间经皮下注射来源于供体恒河猴外周血诱导培养的转染空载体的imDC细胞与转染抑制miR-let-7i基因的imDC细胞以及空白对照PBS溶液,移植一定的时间后,取下移植皮片进行检验。经RT-qPCR检测,注射转染抑制miR-let-7i基因的imDC组,与空白对照相比,其miR-let-7i的表达显著降低;炎性因子IL-2及IFN-γ的表达显著降低,IL-10、IL-4的表达显著升高。流式细胞仪检测发现,CD4+CD25+Treg细胞百分比显著升高。在移植皮片组织活检中,miR-let-7i inhibitor可以有效抑制IL-2及IFN-γ表达,促进IL-10、IL-4表达,从而影响术后Th1/Th2偏移,促进移植耐受,减轻移植排斥反应。[结 论]本研究首次在恒河猴外周血体外细胞实验验证miR-let-7i对树突状细胞的成熟及功能的影响,并验证了抑制miR-let-7i通过靶向上调CCR7表达抑制Toll样受体信号通路维持DC未成熟状态及影响DC细胞的功能,首次在非灵长类动物恒河猴体内实验验证抑制未成熟树突状细胞miR-let-7i信号能诱导恒河猴皮肤移植后免疫排斥的低反应性。