昆虫病原线虫干燥胁迫的转录组分析与剂型研究

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昆虫病原斯氏(Steinernema)和异小杆(Heterorhabditis)线虫是一类昆虫病原寄生线虫,已广泛应用于害虫生物防治领域。昆虫病原线虫不耐干燥的特性使得其不能长期贮存一直是拓展其应用的主要障碍。  本论文通过测定8种(23个品系)昆虫病原线虫的干燥耐受能力,筛选干燥耐受能力差异的线虫种类;并应用高通量测序(RNA-Seq)技术对干燥胁迫的线虫进行转录组测序,分析不同线虫对干燥胁迫的分子响应;测定吸附性物质作为载体对线虫的贮存效果,建立各种线虫的最佳贮存剂型。本论文将为进一步明确线虫对干燥胁迫应答的分子机制提供基础,为线虫的商业化应用提供科学依据。  论文测定了不同线虫在85%、93%、97%3个相对湿度(relative humidity,RH)环境中处理24h,48h和72h后的存活率。结果表明,斯氏线虫干燥耐受能力强于异小杆线虫,以S carpocapsae线虫干燥耐受能力最强,在RH85%环境中处理72h后存活率仍达80%以上,H.indica线虫干燥耐受能力最弱,在RH93%环境中处理48h后存活率仅为10%左右。筛选了干燥耐受能力差异的线虫S.carpocapsae>S.feltiae>H.bacteriophora>S.glaseri、H.indica作为后续研究的对象,并确定RH93%作为干燥胁迫条件制备转录组测序的样品。  对干燥胁迫0h、8h、20h、32h线虫样品的转录组数据进行分析,S.carpocapsae、S.feltiae、S.glaseri、H.bacteriophora和H.indica线虫分别得到37143795、35272240、19416975、18806431、21182037条高质量reads,经序列比对/拼接,分别得到15984、13891、15524、23516、35515条gene/unigene,其中,获得注释信息的gene/unigene数目分别为12668、10635、11919、21017、8491条,85%以上的序列匹配到脊椎动物寄生线虫、隐杆属线虫等。在整个干燥过程中,各线虫分别获得744、735、851、979、818条差异表达基因,上调表达gene/unigene数量分别占27.95%、65.58%、78.14%、70.28%、75.58%,差异表达的gene/unigene显著富集的pathway分别共17、3、28、13、22条,上调表达基因在不同线虫显著富集的pathway不同,S.carpocapsae线虫为甘油合成,S.feltiae线虫为碳物质代谢,S.glaseri、H.bacteriophora、H.indica线虫主要为过氧化物代谢、脂肪酸降解、辅酶Q的生物合成、苯基丙氨酸代谢等。筛选到Heat shock protein Hsp-12.2和LEA5protein可能分别是昆虫病原线虫响应干燥胁迫和干燥耐受能力差异的关键基因。以qRT-PCR的方法验证每种线虫4个基因的转录水平,结果与转录组测序数据的相关性大于0.87。  采用吸附性物质作为载体,测定了不同配比、不同贮存温度、防霉剂Proxel GXL的添加等对5种线虫贮存的影响。结果表明,S.carpocapsae、S.feltiae、S.longicaudum可按1∶1(w/w)于5℃稳定贮存于蛭石、腐殖土中长达120d,存活率仍大于90%。在蛭石剂型中添加Proxel GXL可将H.bacteriophora和H.indica线虫的贮存时间延长30天。异小杆线虫更适于水中贮存,H.bacteriophora H06线虫在水中贮存60d、H.indica LN2线虫在水中贮存40d后的线虫存活率仍大于90%。
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