论文部分内容阅读
目的黑色素瘤(melanoma)是恶性程度极高的一种肿瘤，占皮肤肿瘤死亡病例的绝大多数。主要发生于皮肤、粘膜和内脏器官。黑色素瘤的复发和转移率较高，预后较差，晚期易通过淋巴道及血液转移。其发病率随人种、地域、种族的不同有所差异。日光照射是黑色素瘤的主要诱因，其他诱发因素还包括家族史，恶性斑痣，较大的先天性黑素细胞痣和发育不良性痣综合征。中国虽属黑色素瘤的低发区，但近年来发病率却呈不断上升趋势。恶性黑素瘤扩散迅速，可在诊断数月后死亡。目前外科手术切除是治疗黑色素瘤的常用方法，早期5年治愈率可达100%。因此早诊断，早治疗是黑色素瘤预后的关键。恶性黑色素瘤对放化疗不敏感，而传统的中药在抗黑色素瘤转移治疗方面展示了良好的应用潜能。白藜芦醇是一种天然多酚类化合物，主要存在于葡萄果皮中。近年来它的抗癌作用已经引起了广泛的关注。许多研究已经证实，白藜芦醇具有广泛的生物学活性，包括神经保护作用、抗癌、诱导凋亡等作用。白藜芦醇已被确定为化学防癌药，能够有效地抑制癌症的发生、发展。体外实验发现白藜芦醇能够抑制B16M细胞与血管内皮细胞的粘附，从而抑制B16M细胞的肝转移。本研究主要探讨黑色素瘤细胞穿越内皮单层过程中白藜芦醇对其表面某些粘附分子表达水平的影响。方法和结果1．白藜芦醇对WM239细胞的毒性作用1.1MTT法检测白藜芦醇对WM239细胞增殖的影响12.5～200μmol/L的白藜芦醇作用于WM239细胞48h和72h后,对其增殖具有一定的抑制作用，作用72h时，浓度在50μmol/L以上其抑制率高于50%，且抑制程度与药物浓度呈正相关。1.2流式细胞术检测白藜芦醇对WM239细胞周期及凋亡的影响其中0、25、50和100μmol/L药物与WM239细胞作用48h后，凋亡率分别为0.1%、9.7%、8.9%和19.3%，处理组与未处理组相比细胞凋亡明显增加，G0/G1期细胞分别为71.9%、77.3%、81.0%和83.7%，S期分别为21.5%、17.9%、16.0%和14.6%，G2/M期为6.5%、4.8%、2.9%和1.8%，细胞周期阻滞于G1期，S期和G2期细胞比例下降，剂量依赖关系明显。2．白藜芦醇对WM239迁移的抑制作用2.1MTT法筛选合适的白藜芦醇浓度应用MTT法检测白藜芦醇对脐静脉内皮细胞（HUVEC）和黑色素瘤细胞（WM239）的毒性作用，以确定实验所需的药物浓度和相应的时间点。结果表明白藜芦醇浓度小于25μmol／L时，48小时内对两种细胞的毒性作用较弱，随着时间的延长和药物浓度的增加，白藜芦醇对两种细胞的毒性作用逐渐增强。2.2RT-PCR检测基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达应用RT-PCR检测白藜芦醇的不同药物浓度作用于WM239细胞后基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达的情况。结果表明随着药物浓度的逐渐升高MMP-9的表达成下降的趋势。2.3白藜芦醇对WM239细胞迁移能力的影响应用Transwell小室法检测不同浓度的白藜芦醇对黑色素瘤迁移能力的影响。结果表明，白藜芦醇能够抑制黑色素瘤细胞的迁移能力。并且随着药物浓度的逐渐增加，WM239细胞的迁移能力逐渐减弱。3．白藜芦醇对WM239与HUVEC共培养体系N-cadherin磷酸化的影响3.1白藜芦醇对WM239和HUVEC细胞共培养体系中N-cadherin表达的影响应用流式细胞术检测WM239细胞和HUVEC细胞共培养体系中N-cadherin表达的情况。结果表明，随着药物浓度的增加N-cadherin表达基本没有变化，这说明，白藜芦醇有可能不是通过抑制N-cadherin表达来干涉WM239细胞转移的。3.2白藜芦醇对WM239和HUVEC细胞共培养体系中N-cadherin胞内段磷酸化及与β-catenin结合情况的影响应用westernblot检测WM239和HUVEC细胞共培养体系中N-cadherin胞内段磷酸化及与β-catenin结合的情况。实验结果表明，N-cadherin胞内段磷酸化的量随着白藜芦醇药物浓度的升高而逐渐降低，N-cadherin胞内结合的β-catenin随着药物浓度的升高逐渐升高。3.3白藜芦醇对Src活化的影响应用westernblot检测WM239和HUVEC细胞共培养体系中Src活化的情况。实验结果表明，随着白藜芦醇药物浓度的逐渐升高，P-Src表达量逐渐降低。结论本研究通过建立黑色素瘤细胞穿越内皮单层的体外模型。探讨了白藜芦醇抑制黑色素瘤转移的相关机制。结果表明，白藜芦醇可以抑制黑色素瘤的侵袭转移能力，并且药物浓度与抑制率呈正相关。白藜芦醇对共培养体系细胞表面粘附分子N-cadherin的表达影响较小，它主要是通过抑制Src的活化，降低了N-cadherin胞内段磷酸化，致使游离的β-catenin减少，从而抑制了相关的基因表达。