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研究背景和目的次氯酸（Hypochlorous acid/Hypochlorous,HOCl）是一种众所周知的生理氧化剂,在正常条件下,起着抗菌剂的作用。次氯酸主要是由髓过氧化物酶（MPO）催化H2O2和氯离子产生。作为细胞中的活性氧之一,HOCl也是一种重要的生长信号,能够参与调控多种细胞生理过程。然而过量的HOCl则会导致癌症、动脉粥样硬化和其它炎症性疾病等。研究发现中性粒细胞产生的HOCl能够诱导肺上皮细胞的DNA损伤和突变,从而引发肺癌。近来研究发现与非肿瘤细胞系相比,肿瘤细胞系中HOCl产量更高,这进一步说明HOCl对于肿瘤的生长调控至关重要。然而关于内源性HOCl调节肿瘤细胞生长的效应分子尚未搞清。因而筛选靶向HOCl的小分子将有助于阐明HOCl在细胞中发挥功能的机制。目前已有较多研究用于开发能够检测内源性HOCl的新工具,在前期研究中,我们也已成功筛选了许多靶向HOCl的小分子,即HOCl探针。但是关于利用这些HOCl探针进一步阐明内源性HOCl功能的研究甚少。在肿瘤细胞中HOCl作为一种调节细胞命运的信号分子,主要通过影响蛋白质的翻译后修饰发挥功能。已有研究发现HOCl能够诱导蛋白质发生氧化和氯化修饰,进而改变其活性。关于外源添加HOCI修饰蛋白质的细胞功能已有较多研究,然而内源性HOCl对蛋白质的修饰以及HOCl修饰的蛋白质调控肿瘤细胞生长的机制仍不清楚。自噬是一个高度调控的生物学过程,其中双层膜包被的自噬小体能够将受损的生物大分子和细胞器包裹,然后与溶酶体融合形成自噬溶酶体,并在溶酶体水解酶的作用下促进待降解底物的降解和回收。自噬在肿瘤细胞生长中发挥双重作用。通常情况下,自噬能够清除受损的蛋白质和细胞器从而促进多种类型肿瘤的存活并激活肿瘤的耐药性。然而越来越多的研究发现自噬也能够抑制肿瘤细胞的生长。已有研究表明HOCl在肿瘤细胞生长调控中发挥重要作用,但是目前HOCl与自噬的关系仍不清楚。凋亡,也称为Ⅰ型程序性细胞死亡,能够有效抑制癌症的进展。研究表明HOCl通过参与caspase-3蛋白半胱氨酸硫醇基的氧化修饰,进而以剂量依赖的方式介导caspase-3失活并抑制卵母细胞凋亡。HOCl也能够通过诱导NF-κB的表达从而增加平滑肌细胞的凋亡抗性。另外,HOCl修饰的白蛋白能够诱导线粒体依赖性细胞凋亡。但是关于内源性HOCl调控肿瘤细胞凋亡的机理尚未搞清。转移是癌症相关死亡的主要原因。研究发现HOCl能够影响内皮祖细胞的迁移并破坏内皮细胞功能。低氧条件下,HOCl能够提高肺动脉平滑肌细胞中NF-κB的表达,进而促进细胞的增殖和迁移。此外,HOCl修饰酪氨酸形成的产物氯酪氨酸通过增加超氧阴离子的产生并活化ERK1/2进而促进人主动脉平滑肌细胞迁移。次氯酸盐诱导的氧化应激能够促进乳腺癌的转移。然而内源性HOCl对肿瘤细胞迁移的调节机制并不清楚。在先前的研究中,我们鉴定了一种基于苯并咪唑-半花菁的新型比率探针（E）-1,3,3-三甲基-2-（2-（4-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基）乙烯基）-3H-吲哚-1-鎓（ZBM-H）,该探针具有高灵敏度并且可以选择性检测活细胞中的内源性次氯酸。但是ZBM-H是否通过影响次氯酸诱导的蛋白质翻译后修饰进而调节肿瘤细胞的命运尚未搞清。在本研究中,我们以ZBM-H为工具,旨在探索次氯酸调控肺癌细胞生长过程中所涉及的潜在效应分子。另外,我们探究了靶向次氯酸的化学小分子ZBM-H调控肺癌细胞自噬、凋亡和迁移的分子机制。因此,我们的研究阐明了内源性次氯酸修饰的蛋白质在肿瘤生长中的功能,并且为内源性次氯酸在肿瘤细胞自噬、凋亡和迁移中的关键作用及其分子机制提供了新的证据。研究内容1.靶向次氯酸的化学小分子ZBM-H激活自噬并抑制肿瘤细胞生长的机制研究。1.1次氯酸探针ZBM-H的细胞器靶向性研究。1.2 ZBM-H激活A549细胞自噬的分子机制研究。1.3 GRP78活性调控的机制研究。1.4 ZBM-H抑制A549细胞生长的作用机制研究。2.ZBM-H调节A549细胞凋亡和迁移的机制研究。2.1 ZBM-H促进A549细胞凋亡的分子机制研究。2.2 ZBM-H抑制A549细胞迁移的作用及其机制研究。研究方法1.利用免疫荧光技术检测小分子与蛋白,以及蛋白与蛋白之间的共定位情况。2.Western blot检测相关蛋白水平以及蛋白的磷酸化水平。3.利用免疫共沉淀技术分析蛋白与蛋白之间的相互作用。4.液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）检测蛋白质的翻译后修饰变化。5.利用RNA干扰或质粒转染等实验方法研究特定蛋白的功能。6.利用定点突变技术构建GRP78点突变质粒:his6-GRP78-wt、his6-GRP78-mut1（K352A）和 his6-GRP78-mut2（K353A）;然后用 Ni-NTA 纯化带有 his 标签的GRP78蛋白;利用ATPase/GTPase活性测定试剂盒检测小分子ZBM-H对GRP78 ATPase活性的影响。7.磺酰罗丹明B（SRB）实验检测细胞存活率。8.Hoechst 33258染色和TUNEL法分析细胞凋亡情况。9.利用鸡胚尿囊膜模型,检测ZBM-H对体内肿瘤生长和血管生成的影响。10.微量热泳动（MST）实验检测小分子ZBM-H与GRP78蛋白的结合情况。11.利用细胞划痕实验分析细胞迁移情况。研究结果1.ZBM-H能够靶向内质网和GRP78。1.1 ZBM-H以时间依赖的方式与内质网共定位,而不与线粒体共定位。1.2 ZBM-H在细胞内与经典的内质网标志蛋白葡萄糖调节蛋白78（GRP78）具有良好的共定位。1.3在有无ATP存在的条件下,ZBM-H均能够直接与GRP78结合。2.GRP78/AMPK/mTOR信号通路参与ZBM-H诱导的自噬。2.1 ZBM-H以时间和浓度依赖的方式促进A549细胞自噬,并且能够诱导完整的自噬流。2.2 ZBM-H以时间和浓度依赖的方式促进GRP78与AMPK的相互作用,并提高AMPK的磷酸化水平。2.3敲低GRP78能够有效抑制ZBM-H诱导的自噬以及AMPK磷酸化。另外,AMPK的抑制剂Compound C联合处理能够抑制ZBM-H诱导的自噬。ZBM-H可以抑制mTOR活性,而mTOR的激活剂3BDO能够抑制ZBM-H诱导的自噬。3.ZBM-H通过抑制次氯酸诱导的GRP78 Lys353氧化修饰进而提高其活性。3.1 ZBM-H能够抑制次氯酸诱导的GRP78 Lys352和Lys353氧化修饰。在转染his6-GRP78-wt 和 his6-GRP78-mut1（K352A）的细胞中,ZBM-H 能够提高AMPK的磷酸化水平。而在A549细胞中转染his6-GRP78-mut2（K353A）后,ZBM-H则不能促进AMPK的磷酸化。3.2 ZBM-H以时间和浓度依赖的方式提高GRP78 ATPase活性。K352A突变不影响ZBM-H激活GRP78 ATPase活性。K353A突变后,ZBM-H则不能提高GRP78ATPase 活性。4.ZBM-H抑制A549细胞生长,同时其诱导的自噬能够促进细胞凋亡。4.1 ZBM-H以浓度依赖的方式抑制A549细胞的存活,其IC50为1.648 μM。4.2在A549细胞中,ZBM-H处理能够提高BAX的蛋白水平并促进caspase12和PARP的切割。同时,ZBM-H处理A549细胞后,出现显著的染色质凝集。4.3自噬抑制剂3BDO能够抑制ZBM-H诱导的细胞凋亡并部分恢复细胞存活率。5.ZBM-H通过结合次氯酸并干扰其功能进而抑制细胞生长。5.1外源次氯酸能部分逆转ZBM-H抑制的细胞存活率并显著抑制ZBM-H诱导的AMPK磷酸化。5.2 his6-GRP78-mut2（K353A）能够在一定程度上保护细胞免受ZBM-H诱导的死亡。6.ZBM-H在体内能够抑制肿瘤生长。6.1 ZBM-H在体内有效抑制异种移植瘤的生长,并促进肿瘤细胞的自噬和凋亡。6.2 ZBM-H对于鸡胚尿囊膜正常的血管生成没有影响。7.ZBM-H能够促进GRP78与ANXA7的结合进而调控ANXA7的活性并诱导ITGB4的磷酸化和A549细胞凋亡。7.1 ZBM-H能够以浓度依赖的方式促进GRP78与ANXA7的相互作用。7.2 ZBM-H以时间和浓度依赖的方式促进ITGB4磷酸化。7.3 ANXA7的抑制剂ABO处理细胞能够抑制ZBM-H诱导的ITGB4磷酸化和细胞凋亡,而ANXA7的激活剂SEC的作用与之相反。7.4 与过表达 mCherry-ANXA7-wt 相比,过表达 mCherry-ANXA7-mut2（T286A）可抑制细胞凋亡。8.ZBM-H能够抑制A549细胞迁移并降低ITGB4的蛋白水平。8.1 ZBM-H能够抑制A549细胞迁移并抑制EMT过程。8.2 ZBM-H以时间依赖的方式降低ITGB4的蛋白水平。9.ZBM-H通过促进ANXA7与Hsc70的结合,进而调节ITGB4的选择性自噬及降解,最终抑制细胞迁移。9.1自噬抑制剂3BDO与ZBM-H联合处理能够部分恢复ITGB4的蛋白水平。9.2自噬抑制剂3BDO处理能够部分减弱ZBM-H抑制的A549细胞迁移。9.3 ZBM-H能够促进ANXA7与Hsc70的相互作用,进而参与调控ITGB4的选择性自噬及降解。结论1.次氯酸探针ZBM-H能够靶向内质网和GRP78。2.ZBM-H能够以GRP78/AMPK/mTOR依赖的方式激活A549细胞自噬。3.ZBM-H通过抑制次氯酸诱导的GRP78 Lys353氧化修饰进而提高其活性。4.ZBM-H通过结合次氯酸并干扰其功能进而抑制A549细胞生长。5.ZBM-H能够增强GRP78与ANXA7的相互作用进而调控ANXA7活性并诱导ITGB4的磷酸化和A549细胞凋亡。6.ZBM-H通过促进ANXA7与Hsc70的相互作用进而诱导ITGB4的选择性自噬及降解,并抑制A549细胞迁移。