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研究背景口腔鳞状细胞癌（OSCC）是指癌症发生在嘴唇的红唇和硬软腭或舌后三分之一的交界处,是最常见的口腔恶性肿瘤,占口腔恶性肿瘤的80-90%。在世界范围内,口腔癌是高发的,发病率占全身恶性肿瘤的第六位。口腔鳞状细胞癌的主要病因和诱发因素有吸烟和饮酒习惯,以及紫外线辐射（特别是唇癌）,有时和人类乳头状瘤病毒（HPV）念珠菌感染,营养不足和遗传易感性等因素有关。口腔鳞癌的5年生存率是50%。早期病变,无明显临床症状,预防的方法主要是通过筛查来及早发现。手术在大多数口腔癌的治疗中起着重要的作用,辅以化疗或放射治疗。锌指蛋白750（ZNF750）的缺失和突变和鳞状上皮生物学特性相关,锌指蛋白含有锌指结构,通过肽链中氨基酸残基基团与Zn2+特异性结合,来稳定多肽空间构型。本文中所研究的ZNF750基因（GenBank Accession No.NM024702）编码了一种锌指蛋白,通过生物信息学分析得出该蛋白ZNF750包含有ZnF-C2H2型结构域。近些年来的研究表明,C2H2型锌指蛋白的异常表达有可能引起不同方面不同程度肿瘤的发生,锌指蛋白相关基因的敲除或干扰对口腔鳞癌细胞的增殖生长能力会产生一定的影响。目前,口腔鳞癌的临床治愈率依旧不高,所以找到与口腔鳞癌相关的灵敏度高特异性好的基因十分重要,是治疗口腔鳞癌的新突破口。在本次研究中,我们首先对ZNF750进行了生物信息学分析预测,并根据其碱基序列设计并合成shRNA,采用慢病毒载体将其有效的整合到人舌鳞癌细胞CAL-27内,以达到持久性的干扰效果,从而对ZNF-750锌指蛋白的表达产生有效的干扰,观察ZNF750基因被沉默后人舌鳞癌细胞CAL-27的存活情况、增殖能力和迁移能力。以β-actin为内参,通过real time PCR检测干扰后细胞内ZNF750基因的转录水平及干扰病毒的干扰效率。使用Western blotting技术检测对应锌指蛋白表达水平的变化。通过划痕实验观察ZNF750基因被沉默时癌细胞的迁移运动与修复能力。采用Transwell实验验证ZNF750过表达后对癌细胞体外侵袭能力的影响。进行常规MTT法检测在ZNF750基因被沉默的条件下细胞的增殖能力。材料与方法1.实验所用载体、菌株及细胞本次研究所用载体包括慢病毒包装质粒pCMV-△8.2,和pCMV-VSV-G;克隆菌为大肠埃希菌DH5α;实验中慢病毒包装所用细胞HEK293T由其他实验室惠赠所得,干扰所用细胞人舌鳞癌细胞CAL-27从天津塞尔生物公司购买所得。2.ZNF750的生物信息学分析以及shRNA的设计应用NCBI查询ZNF750核苷酸及蛋白序列,利用ExPASy服务器预测理化性质,ProtScale程序分析亲疏水性,TMHMM Server v.2.0预测信号肽、跨膜区,利用SWISS-MODEL在线预测蛋白结构以及SMART服务器预测结构功能域。根据NCBI查询的结果设计ZNF750的shRNA靶点,并送至上海生工公司进行合成,然后构建慢病毒载体进行实验。3.针对ZNF750的RNA干扰及干扰效果分析将包装好的慢病毒对CAL-27进行感染,培养后于倒置荧光显微镜下观察荧光预估慢病毒对细胞的感染效率。用qPCR和Western blotting实验对干扰后ZNF750的转录水平和表达水平;划痕实验观察鳞癌细胞的迁移运动与修复能力;应用Transwell实验观察ZNF750基因沉默后对细胞体外侵袭能力的影响;MTT实验检测干扰后细胞的增殖能力。4.统计学处理应用SPSS17.0统计软件及Graphpad Prism软件对实验结果数据进行整合、处理并分析。采用均数±标准差的数据形式,合理使用各项统计学处理方法,包括两两比较、卡方检验和方差分析,比较实验组和对照组以及正常组间的实验结果,检验水准为α=0.05。结果1.ZNF750锌指蛋白生物信息学分析及沉默后对口腔鳞癌细胞的影响通过生物信息学分析方法对ZNF750基因分析结果如下:ZNF750全长3218bp,编码蛋白大小约为79kDa,含有一个已知的ZnF-C2H2功能结构域,不含信号肽,无跨膜区,蛋白无明显疏水性。利用克隆表达技术,成功构建慢病毒载体,经酶切和菌落PCR验证显示条带位置正确,后送至上海生工进行测序,测序结果表明慢病毒载体正确构建。待包装好的慢病毒成功感染鳞癌细胞CAL-27后,进行qPCR和Western blotting实验,实验结果显示经慢病毒干扰后,CAL-27细胞ZNF750基因转录水平与蛋白表达量较正常对照组有明显的下降。划痕实验结果显示干扰组相较对照组,划痕有了明显的修复,宽度明显减小,不过空白组和空质粒对照组划痕也有部分修复。当培养48h后再次观察拍照时,空白组细胞划痕与PM7.1空质粒对照组的划痕修复程度几乎一致,而PM7.1-ZNF750sh实验组中的划痕虽然也未完全修复,但却是三组中修复程度最高的一组。表明沉默了ZNF750后会导致鳞癌细胞迁移和修复能力增强。Transwell实验结果表明当ZNF750基因沉默后能导致癌细胞体外侵袭能力增强。MTT实验提示下调ZNF750蛋白表达量有利于促进鳞癌细胞的增殖生长。结论1.本研究根据ZNF750基因序列设计shRNA并成功构建了慢病毒载体,对CAL-27细胞内ZNF750基因进行干扰。2.ZNF750锌指蛋白可作为目前口腔鳞癌诊断与治疗的新方向新突破口,为下一步深入研究ZNF750基因调节机制奠定了基础。