脑卒中是当前威胁人类健康的主要疾病之一。目前脑卒中已跃居为中国的首位死因,其中缺血性脑卒中发生率占80%-85%。世界卫生组织调查结果显示,目前中国脑血管病发病率居世界首位,约高于美国1倍。缺血性脑卒中具有发病率高、致残率高、复发率高,治疗费用高等特点,在现存的脑卒中患者中,约75%不同程度地丧失了劳动力,40%重度致残,严重影响患者的健康和健康生存质量,给家庭和社会带来沉重的负担。脑梗死后继发性脑损伤是病情加重的关键因素,如何减轻继发性脑损伤是临床面临的重要课题,其损伤机制复杂,主要涉及兴奋性氨基酸毒性、氧化应激损伤、炎症反应及细胞凋亡等病理过程。目前经临床证实的唯一有效药物是重组组织型纤溶酶原激活物(recombinant tissue-type plasminogen activator,rt-PA),但其狭窄的治疗时间窗(3-6 h内),和脑缺血再灌注损伤、脑水肿,甚至脑出血等并发症,其临床应用受到限制。因此寻找快速有效的对抗脑卒中的药物,一直是生命科学研究的热点和医学工作者努力的方向。祖国传统中草药具有效果明显,毒副作用小,也具有多靶点、多方向及多途径的作用等优点。因此,我们从中草药中筛选具有神经保护作用的药物。千金藤素(cepharanthine,CEP)是从防己科千金藤属植物中提取分离出来的生物碱之一,具有较强的生物活性。CEP临床上主要用于治疗肿瘤患者因放、化疗及其它原因所致的白细胞减少症。研究报道,CEP抑制TNF-α诱导的NF-κB的表达、血小板聚集、细胞因子生成,改善大鼠肾脏缺血再灌注损伤。诸多实验研究表明千金藤素具有抗炎、抑制氧化应激、抗肿瘤、增强免疫功能等多种生物学作用。CEP还具有低毒、低廉的特点,如果能证实CEP为理想的神经保护剂,将具有重要的临床意义,目前有关CEP在缺血损伤中的研究和应用鲜有报道。本研究选用雄性CD-1小鼠为研究对象,采用线栓法建立脑缺血模型,观察脑缺血损伤后血脑屏障的改变及p38MAPK(mitogen-activated protein kinases)、JNK(c-jun N-terminal kinase)、NF-κB(nuclear factor-kappa B)及NLRP3、IL-1β等炎症因子,并选用CEP进行干预,评价干预前后梗死体积、神经功能缺损评分。探讨CEP对NF-κB和p38MAPK、JNK信号通路和NLRP3、IL-1β的抑制在缺血损伤诱导脑保护作用机制进行初步探讨。本研究分三部分,现将各部分内容概述如下。第一部分千金藤素对局灶性脑缺血小鼠的脑保护作用目的:观察局灶性脑缺血后神经功能缺损评分、脑梗死体积。研究千金藤素对脑缺血小鼠的神经保护作用,探讨千金藤素神经保护作用的治疗时间窗。方法:选用成年雄性CD-1小鼠为研究对象,采用改良线栓法制备大脑中动脉缺血模型。试验随机将CD-1小鼠分为5组:假手术组(Sham)、手术组(MCAO)、小剂量千金藤素干预组(CEP-10)(10 mg/kg)、中剂量千金藤素干预组(CEP-20)(20 mg/kg)、大剂量千金藤素干预组(CEP-40)(40mg/kg)。Sham组:假手术后即刻腹腔注射等量生理盐水。MCAO组:术后即刻腹腔注射等量生理盐水。CEP-10组:术后即刻腹腔注射千金藤素10 mg/kg。CEP-20组:术后即刻腹腔注射千金藤素20 mg/kg。CEP-40组:术后即刻腹腔注射千金藤素40 mg/kg。各组取材前进行神经功能评分,TTC染色评价脑梗死体积。结果:1 Sham组无神经功能缺损,神经功能缺损评分为0分;MCAO组在24 h和72 h神经功能缺损评分较重;CEP-10组在24 h和72 h与MCAO组相比神经功能缺损评分没有明显降低,差异无统计学意义(P>0.05),CEP-20组和CEP-40组在24 h和72 h与MCAO组相比神经功能缺损评分明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。2 CEP-10组的脑梗死体积在24 h和72 h与MCAO组相比均没有显著降低,差异无统计学意义(P>0.05),CEP-20和CEP-40组的脑梗死体积在24 h和72 h分别与MCAO组相比均明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。据此以上的结果,表明千金藤素大剂量(40 mg/kg)和中剂量(20 mg/kg)可以发挥较好的治疗效果,因此,我们选择中剂量千金藤素组(20 mg/kg)进行探讨其保护机制。结论:缺血后即刻腹腔注射千金藤素对局灶性脑缺血小鼠具有脑保护作用,能够改善脑缺血损伤后的神经功能缺损和减小脑梗死体积。第二部分千金藤素对局灶性脑缺血小鼠血脑屏障的保护作用及其相关目的:观察脑缺血损伤后血脑屏障的变化,研究千金藤素对局灶性脑缺血小鼠血脑屏障的保护作用,探讨千金藤素对血脑屏障的保护作用的相关机制。方法:选用成年雄性CD-1小鼠小鼠为研究对象,采用改良线栓法制备大脑中动脉缺血模型。随机将CD-1小鼠分为3组:假手术组(Sham)、手术组(MCAO)、中剂量千金藤素干预组(CEP-20)。Sham组:假手术后腹腔注射等量生理盐水。MCAO组:术后即刻腹腔注射等量生理盐水。CEP-20组:术后即刻腹腔注射千金藤素20 mg/kg。各组于取材前2小时即22小时给予尾静脉注射伊文斯蓝(4 mg/kg)染色测定伊文斯蓝的相对含量。在大脑中动脉闭塞的24 h和72 h后,用干湿重法测定脑组织含水量,分别用q RT-PCR的方法和Western-blotting的方法检测缺血脑组织中ZO-1、occludin、claudin-5 m RNA和蛋白水平的变化。结果:1 CEP-20组的脑组织含水量在24 h和72 h与MCAO组相明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。2 CEP-20组在MCAO术后24 h病变侧脑组织伊文斯蓝含量明显低于MCAO组,差异具有统计学意义(P<0.05)。3通过Western-blotting发现,与MCAO组相比,CEP-20组ZO-1、occludin、claudin-5蛋白表达水平在24 h和72 h与MCAO组相比显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。4通过q RT-PCR发现,CEP-20组ZO-1、occludin和claudin-5 m RNA水平在24 h和72 h与MCAO组相比显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:脑缺血后24 h和72 h,缺血脑组织的ZO-1、occludin和claudin-5显著降低,而千金藤素能够明显上调ZO-1、occludin和claudin-5的表达,提示千金藤素减轻脑水肿、改善血脑屏障的通透性,保护血脑屏障,机制可能是通过上调ZO-1、occludin、claudin-5的表达发挥其脑保护作用。第三部分千金藤素对局灶性脑缺血小鼠的抗炎作用及其相关机制研究目的:观察脑缺血损伤后炎症因子的变化,研究千金藤素对局灶性脑缺血小鼠的抗炎作用,探讨千金藤素抑制炎症反应的相关机制。方法:选用成年雄性CD-1小鼠小鼠为研究对象,采用改良线栓法制备大脑中动脉缺血模型。随机将CD-1小鼠分为3组:假手术组(Sham)、手术组(MCAO)、中剂量千金藤素干预组(CEP-20)。Sham组:假手术后腹腔注射等量生理盐水。MCAO组:术后即刻腹腔注射等量生理盐水。CEP-20组:术后即刻腹腔注射千金藤素20 mg/kg。分别用q RT-PCR的方法和Western-blotting的方法检测缺血脑组织中NF-κB、phospho-p38MAPK、phospho-JNK、NALP3、IL-1β蛋白水平的变化和激光共聚焦技术测定NF-κB、NALP3、IL-1β的表达水平。结果:缺血后24 h和72 h,NF-κB、phospho-p38MAPK、phospho-JNK、NLRP3、IL-1β的表达均有升高,而千金藤素(20 mg/kg)降低局灶性脑缺血小鼠脑组织中NF-κB、phospho-p38MAPK、phospho-JNK、NLRP3、IL-1β的表达。1通过免疫组化染色分析发现,与MCAO组相比,CEP-20组NF-κB、p38MAPK、JNK、NALP3、IL-1β阳性细胞数在24 h和72 h均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。2通过激光共聚焦显微镜发现在神经元有NF-κB、NLRP3、IL-1β的表达。缺血后,NF-κB、NLRP3和IL-1β的表达量明显增多,而千金藤素能够抑制NLRP3、IL-1β的表达及NF-κB核转位。3通过Western-blotting分析发现,CEP组NF-κB、phospho-p38MAPK、phospho-JNK、NALP3、IL-1β的蛋白水平在24 h和72 h与MCAO组相比显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。4与免疫组化染色分析和Western-blotting的结果相一致,CEP-20组NF-κB、NALP3和IL-1β的m RNA水平在24 h和72 h与MCAO组相比明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:局灶性脑缺血后诱导NLRP3、IL-1β表达升高,激活NF-κB和p38MAPK、JNK介导的炎症反应,千金藤素可以抑制NLRP3、IL-1β的表达。因此,我们推测千金藤素可能通过抑制NLRP3、IL-1β,下调phospho-p38MAPK、phospho-JNK和NF-κB蛋白的表达,发挥其抗炎作用,从而减轻缺血脑组织的过度炎症反应并最终实现其脑保护作用。