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5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)在医学和农业等领域具有重要应用,微生物发酵合成5-ALA显示了重要应用前景。本文利用谷氨酸棒杆菌代谢工程合成5-ALA,C4途径代谢工程改造中,研究了血红素合成途径、甘氨酸途径、5-ALA运输蛋白的过表达对5-ALA合成的影响;C5途径代谢工程改造中,研究了关键酶基因hemL和hemA共表达对5-ALA合成的影响。血红素合成途径基因扰动对5-ALA合成的影响。首先,改变heme合成途径中的hemH和hemY基因的初始密码子(ATG-GTG),结果表明下调hemH和hemY基因的表达水平分别使5-ALA的产量提高14.0%和5.3%;IPTG诱导过表达下游基因hemB、hemC、hemD、hemE、hemN、hemH,不同血红素合成相关基因的诱导表达对5-ALA的合成影响不尽相同,其中hemC、hemN基因在不添加IPTG的本底表达水平下显著促进了5-ALA的合成分别提高295%和12.9%;而添加IPTG进一步提高上列6个基因的表达水平均会导致5-ALA的产量显著下降。通过同工酶氨基酸序列同源性分析,发现了谷氨酸棒杆菌5-ALA潜在运输蛋白基因Ncgl2065及Ncgl0580基因,利用低拷贝质粒pEP2对其进行过表达。研究发现,分别过表达Ncgl2065及Ncgl0580的工程菌C.glutamicum R1及R2,5-ALA的产量分别提高了129.5%和100.4%,产量分别达到1.90±0.1 g/L和1.84±0.2 g/L。随后考察了丝氨酸以及甘氨酸合成途径对5-ALA合成的影响。在工程菌C.glutamicum AG3中添加不同浓度的甘氨酸,结果发现在一定浓度范围内,5-ALA的产量会随着甘氨酸浓度的增加而增加,添加7.5 g/L甘氨酸,AG3生产的5-ALA达到2.72 g/L,比C.glutamicum AP2的产量高出了39.5%。为了验证丝氨酸以及甘氨酸反应在5-ALA合成中的作用,通过不同强度地表达以及丝氨酸添加,证明了相对于丝氨酸来说,glyA反应是限速步骤,但是丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)的表达量应该适度,并不是越强越好。在利用C5途径生产5-ALA的过程中,合成了来源于Salmonella typhimurium的hemA基因并进行了密码子优化,同时在该基因第二个以及第三个密码子之间引入AAGAAG,在表达hemA的基础上,分别表达来源于S.typhimurium和Escherichia coli的hemL基因,与前者相比,后者表达后的5-ALA的产量提高了3.3倍。