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重组蝎毒抗神经兴奋肽(ANEP)为来源于蝎毒的多肽类新型基因重组药物,药理实验表明具有良好的抗神经兴奋活性。本文在对ANEP进行可溶性表达与分离纯化的基础上,对ANEP的基本性质进行了系统的研究,并设计以三甲基壳聚糖(TMC)为载体材料制备ANEP纳米粒传递系统(ANEP-TMC/NPs),以期达到在保证ANEP药效的同时兼有一定脑靶向性作用的目的。在对ANEP进行可溶性表达与分离纯化的工作中,将表达质粒pNJUTRX-1-ANEP-His6转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行实验室规模发酵,ANEP表达量占菌体总蛋白约12%,其中可溶性表达部分占90%以上。应用金属离子螯合层析技术将目的蛋白从菌体中分离纯化,将亲和标签His Tag定位于重组多肽的C端以提高纯化效率。ANEP终产量为3.0 mg每升发酵液,纯度>95%。为建立特异性检测ANEP的方法与手段,本文以纯化后的ANEP作为抗原免疫新西兰白兔,8周后制得ANEP的抗血清,并将所得到的ANEP抗血清通过Protein A SepharoseCL-4B柱层析方法分离纯化得到ANEP抗体,该抗体的活性经western blot方法得到验证。利用制得的ANEP抗体,分别建立并考察间接酶联免疫吸附法(ELISA)和间接竞争ELISA分析方法,最终确定以间接ELISA方法进行ANEP的含量测定,该方法的线性范围为0.025～1.600μg／mL,R2为0.9994。所建立的特异性检测ANEP的间接ELISA方法能够很好的满足ANEP体外测定的要求,该项研究目前尚未见到国内外的有关报道。由编码ANEP的基因序列可知,ANEP为由64个氨基酸组成的药用多肽；经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确证ANEP的分子量为8300 Da；等电聚焦法测得ANEP的等电点为5.2,为偏酸性蛋白；摇瓶法测得ANEP在正辛醇／pH 7.4 PBS中表观分配系数为0.17,为水溶性蛋白。对ANEP的热稳定性、pH值稳定性、冻融稳定性、超声稳定性进行研究,结果表明ANEP的热稳定性良好,在偏酸性环境下易降解,对反复冻融和超声较为敏感。针对ANEP为水溶性蛋白类药物,对外界环境较为敏感易降解的性质特点,采用制备条件温和的离子胶凝法制备包载ANEP的纳米粒,以期获得具有一定脑靶向作用的阳离子纳米粒制剂。首先以壳聚糖为原料,通过甲基化反应制备壳聚糖的衍生物三甲基壳聚糖,采用IR、1HNMR对产物进行结构确证并计算样品的取代度。产物三甲基壳聚糖的水溶性和荷电性较壳聚糖得到了大幅度的提高。在制备载药纳米粒的过程中,以包封率、载药量和粒径为评价指标,在单因素实验的基础上通过正交设计实验优化处方,得到最优处方为：TMC的取代度为36.1%,TMC/TPP (w/w)的比值为4.5,TPP浓度为0.6mg/mL, ANEP投药量为2.0 mg。按照最优处方制备的纳米粒包封率为80.63±2.36%,载药量为185.4±5.4μg／mL,粒径在255±11 nm,Zeta电位为32.0±2.12 mV,制剂的pH值为6.61。对制剂进行稳定性考察,结果表明纳米粒制剂在4℃贮存4周时粒径显著增大,聚集的趋势明显,放置不稳定。为了提高纳米粒的贮存稳定性可将产品做成冻干制剂。经过工艺和处方优选制备了以5%的甘露醇为冻干支持剂的ANEP-TMC／NPs冻干粉。所得冻干产品外观饱满致密,以注射用水复溶后能够保持冻干前的各项理化性质基本不变,且制剂的安全性考察合格。在对纳米粒制剂进行药物动力学和组织分布学研究中,将ANEP用异硫氰酸荧光素(FITC)标记,建立荧光分光光度法作为研究ANEP及ANEP-TMC/NPs体内行为特征的分析手段。对高、中、低三个剂量(20,10,5 mg／kg)的FITC-ANEP的药物动力学实验研究表明,高剂量时药物在大鼠体内可能存在剂量依赖性药动学特征,中、低剂量时则具有线性动力学特征。对FITC-ANEP和FITC-ANEP-TMC/NPs的药动学比较研究表明,制剂组的血药浓度较溶液组平稳且中后期略有提高,制剂组的平均滞留时间(MRT)与溶液组比较稍有延长,但二者无显著性差异(P>0.05)。进行小鼠体内的组织分布研究,静注给药后FITC-ANEP-TMC/NPs和FITC-ANEP在脑组织中的峰浓度比值(Ce值)为2.236,相对于溶液组,纳米粒制剂组ANEP在脑内的分布得到了显著的增加(P<0.01),表现出了制剂预期的脑靶向作用。通过将载体材料三甲基壳聚糖标记FITC后制备纳米粒对脑靶向机制作进一步的研究探讨,实验表明ANEP-FITC-TMC/NPs能够透过血脑屏障在脑中分布,推测吸附介导的胞吞作用为制剂具有脑靶向的原因,验证了三甲基壳聚糖作为脑靶向制剂载体的可能性。纳米粒制剂相对于ANEP溶液在表现出脑靶向的同时对肝也有着较明显的趋向性。溶液组和制剂组的药物都主要通过肝、肾被代谢清除。载体材料FITC-TMC在血浆中的消除实验表明,FITC-TMC在血中无长期滞留现象,能够被完全消除,该载体材料的生物可降解性较好。