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CopC是一个铜伴侣蛋白,含有102个氨基酸残基,分子量大约为10 kDa。核磁结构显示蛋白质在溶液中是由9股p折叠片形成的希腊桶状结构。仅有的一个色氨酸和一个酪氨酸残基位于疏水桶中。CopC对Cu+和Cu2+都有很高的亲和性,Cu2+的结合位点位于蛋白质的N端,由组氨酸残基His1、His91、Glu27和Asp89构成。桶的C端为Cu+结合位点,由四个甲硫氨酸残基Met40、Met43、Met46和Met51组成。两个不同价态的铜离子相距约30 A。芳香族氨基酸如色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)在蛋白质进化过程中被认为是保守的氨基酸残基。其侧链在蛋白质折叠中发挥非常重要的作用。此外,CopC的疏水桶对生物体内铜的转运有重要作用。本文围绕CopC中的芳香族氨基酸残基Trp和Tyr及可能会对疏水桶造成影响的氨基酸进行突变,利用定点突变技术构建并得到了十种CopC突变体基因与大肠杆菌表达载体的重组质粒(Y79F、Y79W、 Y79WW83L、Y79WW83F、V81H、D89G、A85M、Y79T、Y79S、Y79H,其中Y79F、 Y79W、Y79WW83L、Y79WW83F由郑晓艳博士构建),并将重组质粒转入大肠杆菌(E. coli) BL21中进行高效表达,经阴、阳离子柱纯化,电泳、紫外光谱等表征、鉴定,获得了较高纯度的目的蛋白(Y79F、Y79W、Y79WW83L、Y79WW83F、V81H、 D89G、A85M)。化学变性剂引起蛋白质去折叠是用于测定蛋白质稳定性的常用方法,可获得吉布斯自由能或m(是描述结构基元对变性剂敏感程度)和[D]1/2(50%蛋白质由天然态转变为解折叠态时的变性剂浓度)等参数。为了更准确地描述分子量较大的蛋白质的稳定性,本文提出了用于蛋白质稳定性研究的结构基元模型。该模型假设蛋白质由结构基元组成,结构基元的解折叠服从“两态”机理。结构基元的解折叠自由能通过线性外推法求得。蛋白质的解折叠曲线是所有结构基元解折叠曲线的线性叠加。蛋白质平均结构基元自由能是所有结构基元自由能的几率求和。蛋白质的解折叠自由能是平均结构基元自由能的n(结构基元数目)倍。此外,简介了受控分子动力学模拟(SMD)方法用于蛋白质稳定性研究。为了探测Trp83及Tyr79在维系蛋白质疏水桶稳定性中所起的作用,本文用荧光光谱、远紫外CD光谱、荧光寿命等方法研究了盐酸胍及尿素引起的CopC及其突变体(Y79F、Y79W、Y79WW83L、Y79WW83F)的解折叠。并用结构基元模型分析了蛋白质的解折叠自由能。数据表明,Y79F及Y79W的平均结构基元自由能比apoCopC分别减小6.51和2.03 kJ/mol。Y79WW83L与Y79W相比,平均结构基元自由能减小11.44 kJ/mol,但Y79WW83F与Y79W相比,平均结构基元自由能增加1.82kJ/mol。结果表明,突变体的解折叠自由能减小,稳定性降低。Trp83及Tyr79在维系apoCopC疏水桶结构中起着至关重要的作用。其中Tyr79以"Tyrosine Corner"的方式,通过与Thr75形成氢键稳定蛋白质疏水桶结构；而处于疏水环境的Trp83是其芳香基团对蛋白质疏水桶的稳定起到重要作用。ApoCopC的解折叠曲线表现为“两态”,但Cu2+-CopC及突变体Y79WW83F的解折叠均表现为“三态”。依据结构基元模型,三态解折叠曲线意味着CopC至少含有两个结构基元。本文用色氨酸的内源荧光光谱、远紫外CD光谱、TNS、荧光寿命、荧光各向异性测量、SMD模拟等手段研究了SDS及CTAB诱导的CopC的解折叠行为。结果表明,SDS与CTAB均能诱导蛋白质形成中间态,这个中间态只对应着一个结构基元的解折叠。而另一个结构基元只有通过尿素或盐酸胍才能使其解折叠。此外,Cu2、Ag+对CTAB/SDS诱导的蛋白质及突变体解折叠行为的影响证明,表面活性剂诱导的解折叠的结构基元对应着C端,尿素或盐酸胍诱导的解折叠的另一个结构基元对应着N端。因此,推断中间态的结构为C端发生了解折叠,而N端保持完整。为了探索有机小分子在CopC铜氧化还原开关中的作用,通过紫外差光谱、荧光光谱及荧光寿命等方法研究了铜伴侣蛋白apoCopC与小分子HSSC的相互作用。生理条件下,HSSC可与apoCopC形成1：1的复合物,主要作用力为范德华力和氢键。FRET测定、分子对接软件Arguslab模拟HSSC的结合位点位于蛋白质的C端。这将可能影响Cu+的结合性质,从而影响CopC铜转运功能。为了探究CopC两端金属离子结合性质及中央疏水桶对CopC铜调节的机制的影响,构建了可能会对疏水桶产生影响的突变体A85M与V81H,及可能会对两端金属离子结合产生影响的突变体D89G。通过荧光光谱,紫外差光谱研究了蛋白质与金属离子Cu2、Ag+、Hg2+的热力学结合性质。使用抗坏血酸为还原剂,初步探索了突变对Cu2+-CopC还原动力学的影响。