绿脓杆菌(P.Aeruginosa)也称铜绿假单胞菌,是目前引起医院内感染的重要病原菌之一,它的耐药机制很多,而生物膜的形成是一个很重要的耐药机制,也是引起临床治疗失败的很重要原因。经过对铜绿假单胞菌生物膜形成机制的研究发现,铜绿假单胞菌形成生物膜的过程中除了群体感应系统(QS系统)之外,还存在着另一种调节机制-喹诺酮信号系统(PQS系统),喹诺酮类信号分子在生物膜的形成机制中则是作为PQS调控系统的主要的信号分子。喹诺酮类药物的结构与喹诺酮信号分子相似,都是以喹啉环为主体的结构,那么喹诺酮类药物在生物膜的形成中到底充当什么角色?它能否诱导生物膜的形成?临床上有哪些药物能够穿透生物膜,从而更有效的治疗铜绿假单胞菌生物膜引起的感染?围绕着上面的问题,本课题展开了以下研究。1.左氧对生物膜诱导作用及其它药物对生物膜形成的影响实验目的：用左氧氟沙星体外诱导铜绿假单胞菌标准菌株与临床分离菌株,观察左氧氟沙星对铜绿假单胞菌形成生物膜的诱导作用；在实验里加入阿奇霉素、亚胺培南与氨溴索,观察这些药物对生物膜的作用,观察是否能破坏细菌生物膜结构或延迟生物膜的形成。实验用菌株：三株铜绿假单胞菌,标准菌株ATCC27853为本室保存菌株,其余两株为野生菌株,临床分离获得。实验方法：(1)左氧对生物膜诱导作用使用左氧氟沙星诱导铜绿假单胞菌,细菌经四十代的诱导后,用银染与电镜两种方法观察生物膜,与诱导前的菌株进行对比,观察左氧氟沙星在诱导铜绿假单胞菌生物膜形成上的作用。(2)阿奇霉素、亚胺培南、氨溴索对生物膜形成的影响取六株铜绿假单胞菌(使用左氧氟沙星诱导前后的各3株),进行以下实验,放入培养液不经培养直接加入阿奇霉素、亚胺培南、氨溴索,观察同一时间内生物膜的形成情况。另取同样的六株铜绿假单胞菌,培养足够的时间,形成生物膜后,加入阿奇霉素、亚胺培南、氨溴索,通过振荡和高温高压的方法,比较已形成生物膜的变化。取使用左氧氟沙星诱导前后的铜绿假单胞菌菌株各3株,培养形成生物膜后,加入氨溴索,电镜观察它们的区别。实验结果：(1)标准菌株编号H007,野生菌株编号P012、P033,诱导四十代后产生菌株编号：H031、H038、H039。从银染和电镜的结果中可以看出在同一时间内经过左氧氟沙星诱导的铜绿假单胞菌,与未经使用左氧氟沙星诱导的铜绿假单胞菌形成的生物膜差别明显。(2)从实验结果中加入阿奇霉素、亚胺培南后可以看出经左氧氟沙星诱导后的菌株,加入阿奇霉素和亚胺培南后生物膜形成的时间比未经过诱导的菌株产生生物膜的时间早。未加入阿奇霉素与亚胺培南的菌株比加入阿奇霉素、亚胺培南的菌株形成生物膜的时间早。加入阿奇霉素、亚胺培南的菌株振荡后生物膜恢复的速度比不加入阿奇霉素、亚胺培南的菌株慢。高温高压之后被左氧氟沙星诱导过的铜绿假单胞菌生物膜经过125℃、0.15MPa的高压20min,生物膜仍然完好无损,加亚胺培南的管经过高压后生物膜消失。加入氨溴索后,电镜下观察经左氧氟沙星诱导和未经左氧氟沙星诱导的铜绿假单胞菌菌株生物膜表面都被打上孔洞。2.建立体外铜绿假单胞菌生物膜形成的实验模型装置实验目的：按照文献报导的方法进行改进,用0.22μm微孔滤膜建立一个体外生物膜模型,并且用此装置进行能透过生物膜的药物筛选,用高效液相色谱仪检测透过生物膜的药物的含量。实验用菌株：两株铜绿假单胞菌,一株为标准菌株H007,另一株为第一部分通过左氧氟沙星诱导而得到的H031。实验方法：建立装置,使用氨溴索促进环丙沙星透过实验用于检验装置是否建立成功。用精密度实验检测装置使用的可重复性。实验结果：未使用左氧氟沙星诱导的铜绿假单胞菌中,未加入氨溴索的菌株环丙沙星透过的量为3.136μg·ml-1和3.270μg·ml-1,透过率为3.136%和3.270%,加入氨溴索后,环丙沙星的透过量为3.911μg·ml-1和4.3796μg·ml-1,透过率为3.911%和4.379%；使用左氧氟沙星诱导的铜绿假单胞菌,未加入氨溴索的菌株,环丙沙星的透过量为1.6557μg·ml-1和1.6825μg·ml-1,环丙沙星的透过率为1.6557%和1.6825%,加入氨溴索的菌株中,环丙沙星的透过量为3.4660μg·m1-1和3.4206μg·ml-1,透过率为3.4660%和3.4206%。3.氨溴索分别与四种抗生素联合使用对铜绿假单胞菌生物膜的透过作用实验目的：筛选能够透过铜绿假单胞菌生物膜的抗生素,为临床上治疗生物膜感染提供科学依据。实验用菌株：三株铜绿假单胞菌,一株为标准菌株H007,另两株为实验一通过左氧氟沙星诱导而得到的H031和H039。实验方法：用氨溴索分别与亚胺培南、头孢哌酮／舒巴坦、哌拉西林／他唑巴坦、头孢他啶作为透过生物膜的药物,分别用这几种药单独使用作为对照,使用5%-100%MeOH/H2O,40min浓度梯度,用岛津20A高效液相DAD检测仪LC-Solution工作站进行检测。实验结果：头孢哌酮／舒巴坦有峰,并且峰的紫外吸收特征峰与纯品在此处的紫外特征吸收相似,说明头孢哌酮／舒巴坦有可能透过生物膜,对于加入氨溴索后的作用,头孢哌酮／舒巴坦还是能透过生物膜,且透过量增加。4.验证实验实验目的：在不同的高效液相条件下(岛津LC-10A)检测氨溴索对头孢哌酮／舒巴坦的透过作用。实验用菌株：两株铜绿假单胞菌,一株为标准菌株H007,另一株为左氧氟沙星诱导得到的H031。实验方法：分别使用头孢哌酮／舒巴坦与头孢哌酮／舒巴坦+氨溴索作为透过生物膜的药物,用岛津LC-10A高效液相SPD-10AD紫外检测器、浙大N2000工作站检测其透过峰高度。实验结果：只加入头孢哌酮／舒巴坦的装置,透过头孢哌酮／舒巴坦色谱吸收峰高为185.091mAU,同时加入头孢哌酮／舒巴坦和氨溴索的装置,透过头孢哌酮／舒巴坦色谱吸收峰高为207.233mAU。以上研究结论1.左氧氟沙星能诱导生物膜的形成。2.阿奇霉素、亚胺培南有抑制生物膜生长的作用,但是对于已形成的生物膜无效。氨溴索可以在形成生物膜的表面上打孔。3.头孢哌酮／舒巴坦可以透过生物膜,加入氨溴索之后头孢哌酮／舒巴坦透过生物膜的浓度增加,此实验提示这两种药合用可以治疗临床上形成生物膜的铜绿假单胞菌感染。