吴茱萸碱通过mTOR信号通路引起人胃癌SGC-7901细胞凋亡的作用机制

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目的:研究吴茱萸碱诱导细胞凋亡的胱天蛋白酶非依赖途径(caspase-independent)——哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR信号转导通路作用机制,进一步阐明吴茱萸碱的药理作用,为临床治疗和联合用药奠定理论基础。  方法:体外培养人胃癌SGC-7901细胞,1.5μmol/L吴茱萸碱、1.5μmol/L吴茱萸碱和20μmol/L胱天蛋白酶抑制剂(z-VAD-fmk)分别作用于SGC-7901细胞24h:①0.4%台盼蓝监测细胞活力;②MTT比色法观察吴茱萸碱作用胃癌SGC-7901细胞和人体外周血单个核细胞(human normalperipheral blood mononuclear cells,PBMCs)的细胞毒作用;③DNA梯形条带检测细胞凋亡;④Real-time PCR检验mTOR、p70S6K和4EBP1基因的表达情况,采用β-actin作对照;⑤Western Blotting检测mTOR和p-mTOR蛋白表达变化情况,Tublin-α作为内参。⑥Annexin V-FITC/PI双染细胞,利用流式细胞仪观察雷帕霉素(rapamycin)作用胃癌SGC-7901细胞48h后测定细胞凋亡率。  结果:①0.4%台盼蓝测细胞活力>95%;② MTT结果显示,吴茱萸碱诱导SGC-7901细胞凋亡存在时间剂量依赖性,且对人类PBMCs无细胞毒作用;③DNA梯形条带显示吴茱萸碱可诱导凋亡细胞DNA断裂,且z-VAD-fmk可抑制与胱天蛋白酶相关的凋亡;④Real-time PCR结果显示吴茱萸碱、吴茱萸碱与胱天蛋白酶抑制剂可使SGC-7901细胞内的mTOR、p70S6K和4EBP1基因表达减低,组间存在显著性差异(P<0.05),且加抑制剂后阻断胱天蛋白酶作用后,吴茱萸碱的抑制作用加强;⑤Western Blotting结果显示吴茱萸碱可以抑制mTOR和p-mTOR蛋白的表达无论是否有z-VAD-fmk的参与,但是加抑制剂z-VAD-fmk阻断胱天蛋白酶作用后,吴茱萸碱的抑制率增强;⑥流式分析,与对照组(1640培养基组)比较,rapamycin浓度为1ng/L作用SGC-7901细胞48h后,早期凋亡率无差异,10ng/L、100ng/L早期凋亡率分别为6.85%、11.98%。存在显著性差异(P<0.05)。  结论:吴茱萸碱可能通过mTOR信号途径促进SGC-7901细胞凋亡。
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