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打破铵抑制，获得耐铵泌铵固氮菌株一直是生物固氮研究的热点。通过化学诱变、基因重组技术获得的第一、二代泌铵固氮菌株存在生长能力低或固氮酶活下降、铵分泌能力偏低等问题而无法在田间广泛应用。因此，构建具高效固氮能力的新一代基因工程菌株具有重要的理论研究与实际应用价值。本研究在完成固氮施氏假单胞菌 A1501 全基因组测序及开展固氮基因表达调控、氮代谢及铵转运机制的工作基础上，通过人工设计固氮调节相关基因功能模块来提高菌株耐铵泌铵能力，具体内容和结果如下：
1.根据A501全基因组序列，将双元调控系统转录激活蛋白NtrC、sigma因子RpoN、固氮正调节蛋白NifA、以及参与调控固氮酶活性的非编码RNA NfiS等功能模块相对应的编码基因至克隆至穿梭载体pLAFR3，将其分别转入A1568（铵转运载体蛋白AmtB缺失突变株）及A1501中，获得8株基因工程菌株。
2.采用qRT-PCR技术检测重组菌株内目的基因的表达水平，结果表明在相同培养条件下，重组菌株内ntrC、rpoN、nifA、nfiS基因转录水平相比于对照菌株（A1501或A1568）均提高2倍以上，说明目的基因在菌体内实现了过表达。
3.在2 mM NH4+浓度下，三个重组菌株：A1501/nifA、A1568/nifA、A1568/ntrC仍保持固氮活性，其中A1501/nifA、A1568/nifA固氮酶活性可达无氮条件下的1.5倍。A1568/ntrC在2mM NH4+浓度条件下也仍维持一定的固氮能力，而其它菌株均未检测到固氮酶活。上述结果表明nifA基因的过表达对于菌体固氮酶耐铵性发挥积极作用。在无氮条件下培养测定各菌株的泌铵量，野生型A1501及其衍生菌株均无明显泌铵能力，而A1568、A1568/ntrC培养基中泌铵量达到2.5μM。说明铵转运载体蛋白的缺失，有利于细胞的泌铵作用。
4.将重组菌株接种宿主植物水稻，重组基因工程菌A1501/nifA在株高、植株干重上较其他菌株都有明显优势。无氮微好氧条件下，有6株工程菌株的固氮酶活比对照菌株降低10% ~ 40%。qRT-PCR结果显示，除A1568/ntrC外，重组菌株内的固氮酶结构基因nifH转录水平出现相应下调，A1568/ntrC内nifH转录水平分别为A1501、A1568的3.2倍和10.3倍。但在固氮酶活表型上，并不表现高水平的固氮能力，这为下一步如何提高泌铵菌株的固氮酶活或将不同代谢途径的基因进行组合改造提供实验依据。
1.根据A501全基因组序列，将双元调控系统转录激活蛋白NtrC、sigma因子RpoN、固氮正调节蛋白NifA、以及参与调控固氮酶活性的非编码RNA NfiS等功能模块相对应的编码基因至克隆至穿梭载体pLAFR3，将其分别转入A1568（铵转运载体蛋白AmtB缺失突变株）及A1501中，获得8株基因工程菌株。
2.采用qRT-PCR技术检测重组菌株内目的基因的表达水平，结果表明在相同培养条件下，重组菌株内ntrC、rpoN、nifA、nfiS基因转录水平相比于对照菌株（A1501或A1568）均提高2倍以上，说明目的基因在菌体内实现了过表达。
3.在2 mM NH4+浓度下，三个重组菌株：A1501/nifA、A1568/nifA、A1568/ntrC仍保持固氮活性，其中A1501/nifA、A1568/nifA固氮酶活性可达无氮条件下的1.5倍。A1568/ntrC在2mM NH4+浓度条件下也仍维持一定的固氮能力，而其它菌株均未检测到固氮酶活。上述结果表明nifA基因的过表达对于菌体固氮酶耐铵性发挥积极作用。在无氮条件下培养测定各菌株的泌铵量，野生型A1501及其衍生菌株均无明显泌铵能力，而A1568、A1568/ntrC培养基中泌铵量达到2.5μM。说明铵转运载体蛋白的缺失，有利于细胞的泌铵作用。
4.将重组菌株接种宿主植物水稻，重组基因工程菌A1501/nifA在株高、植株干重上较其他菌株都有明显优势。无氮微好氧条件下，有6株工程菌株的固氮酶活比对照菌株降低10% ~ 40%。qRT-PCR结果显示，除A1568/ntrC外，重组菌株内的固氮酶结构基因nifH转录水平出现相应下调，A1568/ntrC内nifH转录水平分别为A1501、A1568的3.2倍和10.3倍。但在固氮酶活表型上，并不表现高水平的固氮能力，这为下一步如何提高泌铵菌株的固氮酶活或将不同代谢途径的基因进行组合改造提供实验依据。