Graves病(Gravesdisease,GD)是由促甲状腺激素(Thyroid stimulating hormone,TSH)受体刺激性抗体(Thyroid-stimulating antibody,TSAb)引起的,这种抗体与TSH竞争结合于TSH受体(TSH receptor,TSHR),模拟TSH的作用促进甲状腺细胞分裂(导致甲状腺肿),并促进甲状腺激素分泌。除了环境和遗传因素外,免疫缺陷也在GD发病中发挥重要作用。虽然早前研究已经证实GD患者血清中的TSAb是辅助性T细胞依赖性的,但针对TSHR的自身耐受是如何被打破的,以及自身抗体产生的潜在机制并不清楚。在自身免疫性疾病(包括GD)中,许多研究认为打破中枢和外周免疫耐受产生自身抗体是由于免疫调节缺陷所造成。调节性T淋巴细胞(Regulatory T lymnphocyte,Treg)在防止自身免疫性疾病的发生中发挥了重要作用,其主要通过抑制自身反应性T细胞增殖、促发其失活而维持机体的稳态。新近研究提示,除致病性B细胞外,还存在能产生白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)或转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)等细胞因子的调节性B淋巴细胞(Regulatory B lymnphocyte,Breg),主要包括CD1dhiCD5+CD19hi表型。Breg通过产生抑制性细胞因子或分泌抑制性抗体,影响其它免疫细胞,减缓炎症症状。　　 目的：本研究旨在观察GD患者和对照组外周血单个核细胞Treg、Th17、Breg水平的变化,探讨GD的发病机制。　　 方法：明确诊断为Graves病的初发患者20人,同期选取年龄性别匹配的健康对照20人。采集空腹血液标本,空腹静脉促凝血分离血清,测定甲状腺功能[TSH、FT4(Free thyroxine)]和甲状腺自身抗体[甲状腺过氧化物酶抗体(Thyroid peroxidaseantibody,TPOAb)、甲状腺球蛋白抗体(Thyroglobulin antibody,VgAb)和TSAb]。空腹静脉抗凝血用于分离单个核细胞,免疫荧光染色,流式细胞分析检测外周血单个核细胞(Peviphary blood monolueclear cell,PBMC)中Treg、Th17、Breg细胞水平。实时定量逆转录聚合酶链反应(Quantitative Real-Time Reverse TranscriptePolymerase Chain Reaction,real-time RT-PCR)法检测Treg的转录因子叉头蛋白P3(forkhead box P3,Foxp3)、Th17的转录因子视黄酸受体相关孤儿受体γt(Retinoicacid receptor-related orphan receptorVt,RORγt)、白细胞介素-17(Interleukin-17,IL-17)和IL-10的mRNA水平。所有数据输入SPSS16.0。P＜0.05判定为具有显著性差异。　　 结果：　　 1.Graves病患者CD4+CD25+Foxp3+T细胞百分比与对照组比较明显降低,IL-17+T细胞百分比与对照组比较明显升高,CD1dhiCD5+CD19hiB细胞百分比与对照组比较明显降低。　　 2.GD患者及对照组外周血单个核细胞Th17细胞比例与血清TSAb呈正相关,Treg、Breg细胞比例与TSAb分别呈负相关。　　 3.Graves病患者的Foxp3、IL-10 mRNA表达量低于对照组,而其RORγt和IL-17mRNA表达量显著高于对照组。　　 结论：Graves病患者外周血细胞中CD4+CD25+Treg细胞比例及其转录因子Foxp3mRNA表达水平均明显减少,CD1dhiCD5+Bregs细胞比例及其主要分泌细胞因子IL-10 mRNA表达水平均明显减少,而Th17细胞比例及其转录因子RORγt mRNA表达水平均明显增多。提示Graves病可能与调节性T细胞和调节性B细胞比例降低,而致病性的Th17细胞比例增多有关。　　 背景：理想动物模型的建立是深入研究疾病的发病机制、探索有效治疗措施的途径之一。但迄今为止还没有发现自发的Graves病(Gravesdisease,GD)动物模型。1996年,Shimojo第一次建立了GD的动物模型。此后,研究者相继建立了不同的GD动物模型。GD由TSHR抗体介导产生,因此一直以来被认为是辅助性T细胞2(Helper T cell2,Th2)型自身免疫病。然而,在人和动物中这一观点一直被质疑,认为GD可能并非由经典辅助性T细胞1(Helper T cell1,Th1)/Th2免疫反应所致,有其他免疫反应[如分泌白细胞介素17的辅助性T细胞0nterlettkin-17secreting helper T cells,Th17)]型免疫反应存在。研究表明Th17参与人类自身免疫病的发生发展,如类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)、多发硬化(Multiple sclerosis,MS)、1型糖尿病(Type1 diabetes mellitus,T1DM)及系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)等。RA的血清和关节滑液中IL-17含量很高;MS病变组织的IL-17 mRNA升高18倍;缺失IL17+T细胞可以使实验性自身免疫性脑脊髓炎动物模型(Experimental allergic encephalomyelitis,EAE)等自身免疫病的发病受到抑制:IL-17过表达可促进SLE发展,而将IL-17受体敲除则降低SLE严重程度。自发自身免疫甲状腺炎动物模型NOD.H2h4小鼠的脾和甲状腺内Th17细胞增多,IL-17基因敲除小鼠可抵抗高碘诱导的甲状腺炎。这些结果提示干预Th17细胞免疫途径可能成为自身免疫病治疗的新靶点。一篇发表于2009年6月的《science》杂志上的文章认为溴氯哌喹酮(Halofuginone,HF)可以抑制Th17细胞的分化,而不改变其他正常免疫细胞,减轻自身免疫反应,从而减轻了EAE的发病。因此HF可能在Th17细胞致病的自身免疫病中发挥治疗作用。　　 目的：本研究以TSHRA亚单位-腺病毒(Adenovirus,Ad)载体注射诱导小鼠Graves病动物模型,探讨GD模型发病中Th17细胞、调节性T细胞的变化,以及溴氯哌喹酮(HF)干预对Graves病模型发病及免疫状态的影响。　　 方法：在人胚肾293(Human embryonic kidney293,HEK293)细胞内扩增TSHR A亚单位-腺病毒(Ad-TSHRA)及空载腺病毒(Ad-con)对照,病毒纯化,测定病毒滴度。选择6周龄BALB/c雌鼠,在中国医科大学实验动物中心无特定病原体(Speeefic pathogen Free,SPF)级环境下饲养。将实验动物随机分为4组,每组15只动物。分组如下:　　 1.Graves病模型组:肌注TSHR A亚单位-腺病毒,每三周免疫一次,共免疫三次,第三次免疫后三周处死。　　 2.正常对照组:在相同的环境下,相同时间次数给予空载腺病毒。　　 3.Graves病溴氯哌喹酮干预组:肌注TSHR-A亚单位腺病毒造模的同时,腹腔注射溴氯哌喹酮2μg日/鼠[溴氯哌喹酮溶于二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)中]。　　 4.Graves病溴氯哌喹酮干预对照组:肌注TSHR-A亚单位腺病毒建立GD模型的同时,仅肌注DMSO0.2μl/H/鼠。　　 留取血清,化学发光法检测小鼠游离甲状腺素(Free thyroxine,FT4):促甲状腺激素受体刺激性抗体(Thyroid-stimulating hormone antibody,TSAb)测定:使用稳定表达全长血清促甲状腺激素受体(Thyroid Stimulating Hormone Receptor,TSHR)的中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary,CHO)细胞,加入稀释鼠血清,37℃培养。使用环磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate,cAMP)放射免疫分析(Radioimmunoassay,RLA)试剂盒检测释放到培养液中的cAMP浓度。取完整甲状腺组织,多聚甲醛固定制作石蜡切片苏木素和伊红(Hematoxylin and eosin,HE)染色。取脾制成单细胞,免疫荧光染色、流式细胞学检测Treg、Th17细胞。实时定量逆转录聚合酶链反应(Quantitative Real-Time Reverse Transeripte PolymeraseChain Reaction,real-time RT-PCR)法检测叉头蛋白P3(forkhead box P3,Foxp3)、视黄酸受体相关孤儿受体γt(Retinoic acid receptor-related orphan receptor,RORγt)和白细胞介素-17(Interleukin-17,IL-17)的信使核糖核酸(Messenger ribouncleicacid,mRNA)水平。　　 结果：　　 1、血清FT4和TSAb以Ad-con免疫对照组小鼠-x+3s为正常上限,Ad-con免疫对照组FT4为5.154±0.62 pmol/l,TSAb为(99.4±14.95)％。因此,当小鼠血清FT4＞7.01 pmol/l,TSAb大于144.25％为阳性。Ad-TSHRA组中共15只小鼠,其中10只小鼠血清FT4水平高于正常,11只TSAb高于正常。TSAb与T4呈显著正相关(r=0.843,p＜0.01)。　　 甲状腺组织HE染色,光镜下显示:对照组小鼠甲状腺滤泡大小较一致,细胞排列比较疏松,上皮细胞呈低立方状或扁平状,滤泡中胶质含量比较丰富。Ad-TSHRA造模成功组小鼠甲状腺滤泡细胞增生肥大,呈立方状或高柱状,滤泡大小不一,滤泡腔中胶质含量减少,在增生的甲状腺滤泡中有乳头状折叠凸入滤泡腔,未见淋巴细胞浸润。　　 2、Ad-TSHRA造模+DMSO组中15只小鼠,其中10只小鼠血清FT4水平高于正常,10只TSAb高于正常。Ad-TSHRA造模溴氯哌喹酮干预组GD发病率为10/15,与未干预组发病率无差异。在Ad-TSHR A+DMSO以及Ad-TSHRA+HF组中,甲状腺组织病理学与Ad-TSHRA免疫GD造模组未见明显差异。　　 3、Ad-TSHRA免疫GD造模组和Ad-TSHRA+DMSO组小鼠脾脏Treg细胞比例低于Ad-con免疫组,同时小鼠脾脏Foxp3 mRNA水平亦低于Ad-con组(p＜0.05)。Ad-TSHRA免疫GD造模+HF干预组中,小鼠脾脏Tregs细胞比例及小鼠脾脏Foxp3 mRNA表达均高于GD模型无HF干预组(p＜0.05)。　　 4、无论GD模型组、非GD对照组以及HF干预后的GD模型组小鼠脾脏Th17细胞比例及小鼠脾脏RORγt、IL-17 mRNA表达均未见明显差异(p＞0.05)。　　 结论：　　 1、以TSHRA亚单位.腺病毒免疫6周龄BALB/c雌性小鼠成功建立了Graves病动物模型,成模率66.7％。Graves病小鼠脾细胞中Treg细胞比例降低,Treg细胞的转录因子Foxp3 mRNA表达减少,Th17细胞比例和Th17转录因子RORγt及IL-17 mRNA表达未见明显改变,提示Treg异常或Treg与Th17的表达失衡可能参与GD模型的发病。　　 2、溴氯哌喹酮干预未减少BALB/c小鼠Graves病发病率,但增加了小鼠脾脏内Treg细胞比例和Treg转录因子Foxp3 mRNA表达,但并未改变Th17细胞比例,Th17转录因子RORγt及IL-17 mRNA表达。