【摘 要】
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超越人眼分辨极限的光学显微镜改变了我们看待自然和生命的方式,让我们对事物的发展变化有了更清晰的认知。然而,衍射极限使光学显微镜的观测能力局限于～200 nm以上的空间尺度。突破衍射极限的超分辨显微成像,对于研究超精细的细胞结构、观察复杂的生命活动至关重要,但多数超分辨技术依赖于荧光探测,难以在识别样本特征的同时获得化学成分信息,极大地限制了光学成像的应用范围。因此,开发不受荧光限制的超分辨显微镜具
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超越人眼分辨极限的光学显微镜改变了我们看待自然和生命的方式,让我们对事物的发展变化有了更清晰的认知。然而,衍射极限使光学显微镜的观测能力局限于～200 nm以上的空间尺度。突破衍射极限的超分辨显微成像,对于研究超精细的细胞结构、观察复杂的生命活动至关重要,但多数超分辨技术依赖于荧光探测,难以在识别样本特征的同时获得化学成分信息,极大地限制了光学成像的应用范围。因此,开发不受荧光限制的超分辨显微镜具有重要意义。本文工作基于受激拉曼散射（Stimulated Raman Scattering,SRS）效应,通过直接探测拉曼指纹谱获取图像对比度,并实现了超分辨化学成像。为了提高SRS显微镜的空间分辨率,设计并开发了基于可见光的SRS显微镜,并实现了近共振增强的高分辨化学成像。进一步利用电子共振后发生的基态损耗过程补偿泵浦光子,实现了SRS信号的可逆光开关,并基于光开关开发了超分辨的高光谱SRS显微镜,实现了活细胞的超分辨化学成像。具体内容如下:（1）为了提高传统SRS显微镜的空间分辨率,开发了基于可见光的SRS显微镜。通过光子倍频得到了两束可见光波段的锁相飞秒激光,可见光波段的激发光使图像的空间分辨率提高至～130 nm。近共振效应使可见光系统对生物分子的成像灵敏度提高了一个数量级。通过引入线性啁啾,建立了高光谱成像系统,并利用该系统实现了对中枢神经系统中髓鞘细胞的免标记高分辨化学成像。（2）光开关技术是促进超分辨显微镜发展的关键技术之一。本文通过在光路系统中引入饱和激光诱导基态样本分子的电子态跃迁,有效抑制了SRS过程,并对SRS信号实现了～100%的可逆光开关。（3）设计并搭建了超分辨的高光谱SRS显微镜。通过引入涡旋光抑制焦斑外围的SRS过程,使基于近红外激光的SRS显微镜的空间分辨率突破衍射极限。此外,通过匹配泵浦光与斯托克斯光的线性啁啾系数,优化了光谱分辨率。结合拉曼标签,本文实现了U-2 OS活细胞的超分辨SRS化学成像,图像分辨率比传统的SRS显微镜提高了2.7倍。本文所述工作提高了SRS显微术的空间分辨率,并展示了细胞及组织中精细结构的化学成像,拓展了SRS成像在生命科学领域中的应用。
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