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背景:结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是人类最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率目前在全球分别位于第三位和第四位。该病在欧洲、北美和大洋洲较为多发,而在南亚、中亚及非洲则比较少见。该病在我国的发病率呈现逐年递增的趋势。对于CRC的早期诊断与预后的评价依然是个难题,并且大约有20%的CRC确诊时已经发生了远处转移。目前我国CRC的五年生存率仅为31%。较高的发病率、死亡率,过高的治疗费用以及与病理分期明显相关的高死亡率等原因使CRC的人群筛查显得非常必要。因此,通过在分子水平上探索CRC的发生和进展机制,寻找特异性更强、敏感性更高的诊断标志物,将为CRC的诊断和治疗提供新的靶标和策略。miRNA是一类进化保守的短链RNA分子,长约22个核苷酸,它们的主要作用方式是通过与靶位点的mRNA 3’非编码区（Untranslated Regions,UTR）结合诱导mRNA降解或抑制mRNA的翻译过程从而造成靶基因的蛋白质水平下降。miRNA参与了癌症患者体内多种生物学行为,包括细胞增殖、分化、侵袭、转移和疾病预后等,在不同类型的恶性肿瘤演变中miRNA均扮演了重要角色。单个miRNA可以同时靶向多个基因的mRNA,同时单个mRNA也可以同时被多种miRNA调节。由于细胞内大量的miRNA的存在,这种双向的调节方式构成了细胞内复杂的作用网络,参与了生物体内许多的生理过程和疾病的发生。近些年来,通过研究CRC组织中miRNA表达谱的特点分布,已经发现了 CRC中存在众多表达失调的微小RNA。研究证明这些特异性的miRNA与CRC发病机制、转移、复发和预后密切相关,可能成为恶性肿瘤诊断与治疗的潜在生物标志物。关于miRNA在CRC的作用机制方面的研究已经取得了初步进展,已有研究表明某些miRNA在CRC的致癌性方面具有显著意义。迄今为止,我们对miRNA在癌症组织中的作用机制的研究还只是一部分,其内在的详细作用机理有待进一步研究。我们的研究以CRC组织中特异性的miR-195-5p为出发点,对其在CRC细胞中的生物学功能进行研究,从体内外水平探讨其对CRC的发生发展的影响,以期为CRC的早期诊断和治疗提供新线索。第一部分结直肠癌组织及结直肠癌细胞系中miR-195-5p的表达水平变化目的:验证结直肠癌miRNA芯片数据中筛选出的miR-195-5p在癌组织和细胞系中的表达情况。方法:前期课题组对选取于公共平台上的结直肠癌miRNA芯片数据进行了统计学处理,从中筛选出了具有显著表达差异的miRNA,包括高表达的miRNA和低表达的miRNA。对低表达的miRNA,我们进一步进行了聚类分析,从中筛选出了显著下调且与预后密切相关的miR-195-5p作为研究对象,探索其在结直肠癌组织中扮演的重要角色。我们从武汉大学中南医院肿瘤科2011-2015年间的结直肠癌组织和正常配对组织样本库中,随机选出30对具有明确病理诊断、患者手术前均未接受任何放、化疗等治疗手段的标本,利用qRT-PCR的检测方法对该30对组织样本中miR-195-5p的表达情况进行了测定。同时,自武汉大学细胞库购买了人结直肠癌细胞系HCT116和DLD1与正常肠上皮细胞系NCM460,利用qRT-PCR的检测方法对结直肠癌细胞系与正常肠上皮细胞系中miR-195-5p的表达情况进行了测定。结果:组织样本检测实验结果显示,在结直肠癌组织中miR-195-5p的表达量与癌旁组织中的表达量有明显差异,在结直肠癌中的表达量要明显小于癌旁组织中的表达量,差异具有统计学意义（P<0.001）。这进一步证实了我们前期芯片综合分析的结果。同时,我们也选取了两种结直肠癌细胞系和一种正常肠上皮细胞系作为研究对象,对其表达量进行检测。细胞实验结果显示,miR-195-5p在结直肠癌细胞系中的表达量要明显低于其在正常肠上皮细胞系中的表达量。结论:miR-195-5p在结直肠癌组织和细胞系中低表达,下一步将研究miR-195-5p在结直肠癌中的作用。第二部分miR-195-5p对结直肠癌细胞生物学行为及其在裸鼠体内增殖能力的影响目的:探讨miR-195-5p在人结直肠癌细胞中的生物学功能及在体内环境下对结直肠癌细胞的作用。方法:利用合成的miR-195-5p模拟物和抑制剂及其对照,瞬时转染人结直肠癌细胞株HCT116和DLD1,探讨miR-195-5p在结直肠癌细胞中的生物学功能。利用CCK8和EdU两种方法,检测miR-195-5p对肿瘤细胞增殖能力的影响;利用流式细胞术检测miR-195-5p对肿瘤细胞凋亡的作用情况;利用划痕实验和Transwell实验观察结直肠癌细胞迁移和侵袭能力的变化。通过裸鼠成瘤实验检测miR-195-5p在体内环境下对结直肠癌细胞增殖能力的影响。结果:在细胞功能实验中,CCK-8检测表明在48h和72h时,过表达miR-195-5p组的细胞的OD值与对照组比明显下降,抑制miR-195-5p组的细胞的OD值则明显上升;EdU结果显示,过表达miR-195-5p能够显著减少结肠癌细胞的DNA合成,即抑制细胞的增殖。而抑制miR-195-5p组的细胞与对照组相比,DNA的合成增多,细胞的增殖能力变强;采用流式细胞仪检测的结果显示,与对照组比,过表达miR-195-5p组和抑制miR-195-5p组的细胞中处于早期凋亡的细胞的比例均无明显增高;划痕试验结果显示,与对照组相比,48小时后,过表达miR-195-5p的两种结直肠癌细胞的运动能力受到明显的抑制,而抑制miR-195-5p后,两种结直肠癌细胞的运动能力有所增强;Transwell迁移和侵袭实验结果显示,过表达miR-195-5p组的细胞的迁移和侵袭能力与对照组相比明显下调,而抑制miR-195-5p组的细胞的迁移和侵袭能力与对照组相比有所上升。在裸鼠成瘤试验中,我们证实miR-195-5p能够抑制裸鼠皮下结直肠癌细胞系的增殖能力,实验组的瘤组织的体积与对照组相比明显较小,重量明显较低,表明miR-195-5p在体内环境中也具有明显的抑癌作用。结论:miR-195-5p能够调节结直肠癌细胞的生物学功能。miR-195-5p是一种抑癌性的miRNA,它能够抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。并且其在特定的裸鼠体内环境中也具有明显的抑癌功能,参与了对肿瘤组织生长的抑制作用。第三部分miR-195-5p靶标预测和验证目的:预测miR-195-5p可能的作用靶标并进行验证。方法:通过生物信息学的手段,对miR-195-5p的可能作用靶标进行配对检索,筛选出可能的作用靶基因,并确定其与结直肠癌发生发展的联系。基于功能学方面的结果,采用双荧光素酶报告基因检测的方法测定miR-195-5p在细胞中与靶基因的结合情况,同时结合qRT-PCR分析和Western blot检测方法进一步确认miR-195-5p在细胞中对靶基因的调节情况。并通过qRT-PCR检测、Western蛋白印迹实验及免疫组化试验验证在裸鼠体内环境下miR-195-5p对预测的靶基因的作用。结果:通过几种主要的生物信息学预测方法对miR-195-5p可能的作用靶点进行搜索和筛选后,我们预测到miR-195-5p可能参与了对NOTCH2通路的调节。双荧光素酶报告基因检测的结果说明miR-195-5p能够直接与预测的NOTCH23’UTR结合位点发生特异性结合,具有调控NOTCH2表达的潜能。而该位点突变后,miR-195-5p与NOTCH2原始匹配序列的结合明显下降。qRT-PCR检测和Western蛋白印迹实验结果显示miR-195-5p类似物能导致细胞中NOTCH2通路相关 mRNA（Jagged1,Jagged2,Hey1,Hes1 和 Smad3）和蛋白表达水平降低,miR-195-5p抑制剂处理细胞后NOTCH2通路相关mRNA和蛋白表达水平较对照组呈现一定程度的升高,且这些蛋白的表达量与NOTCH2通路相关mRNA表达量的变化趋势相一致。并且通过对成瘤组织进行的qRT-PCR检测、Western蛋白印迹及免疫组化试验,进一步验证得到了 miR-195-5p在裸鼠体内环境中同样能够抑制NOTCH2通路相关mRNA和蛋白表达的结论。结论:miR-195-5p在结直肠癌细胞及特定的裸鼠体内环境中都能够靶向调节NOTCH2通路的表达。