随着人们生活水平的提高,消耗高能和精制食物逐渐增加,饮食中矿物质含量不断下降;而饮用软水在全世界也越来越多。长期饮用矿物质较低的软水对健康有无负面影响,各家观点不一,争论热烈。其中主要存在两种观点,一方认为:人体矿物质仅5%来源于饮水,绝大部分可以从食物补充。饮水的意义仅在补充水分。另一方则认为:水中矿物元素生物利用率较食物高,在食物矿物质元素摄入不足的情况下,饮水中矿物质元素的贡献是非常有意义的;同时饮用软水能加速机体固有矿物质的排出,增加机体对环境毒物的吸收,所以长期饮用纯净水可能会诱发疾病。但是,上述观点都缺乏系统、科学的研究依据。因此,系统研究长期饮用纯净水后大鼠的生物学效应,对指导科学饮水、维护人们的生命和健康具有重要意义。有报道显示水的适当硬度对于防止从胃中吸收有毒金属具有显著影响。水中缺钙,特别是当食物中钙较低时,小鼠从水中摄取的铅将增加;高钙饮食也能减少重金属的吸收及毒性,比如饮食饮水中钙浓度的增加则可以减少动物对水中有毒重金属镉的吸收。经检索至今未见饮用纯净水是否对铅的吸收、蓄积性及毒性产生影响的研究。于是我们选择纯净水作为软水的代表,以经典重金属毒物—铅为观察对象,构建饮用长期纯净水时慢性铅中毒的动物,探讨长期饮用纯净水是否能增加铅的吸收,是否能增加铅在生物体内的蓄积,从而引起铅的物学效应是否能发生改变,期望为评价纯净水的安全性提供参考。方法:1、动物模型清洁级雄性断乳SD大鼠104只,随机分为8组(每组13只,各组平均体重无显著性差异),各组饮水分别为自来水、纯净水、自来水含铅(醋酸铅)50 mg/L、纯净水含铅50 mg/L、自来水含铅200 mg/L、纯净水含铅200 mg/L、自来水含铅800 mg/L、纯净水含铅800 mg/L。食物及环境等因素均一致。自来水经陶瓷芯过滤,其镁12.7 mg/L,溶解性总固体(TDS) 175 mg/L,电导率350μS/cm,化学耗氧量(COD)低于检测限,铅5.7μg/L。纯净水经检测符合饮用瓶装纯净水国家标准(GB17324-98),其镁0.015 mg/L,TDS 1.16 mg/L,电导率2.28μS/cm,COD低于检测限,铅未检出。2、实验观察指标①观察大鼠一般生长情况,每周称量体重,记录大鼠的饮食、饮水量及自主活动。②于第4、6、8、10、24、28周尾静脉采全血动态监测血铅。③在12、24周时对大鼠进行Morris水迷宫实验中的定向航行、空间探索和可视平台实验。④在28周时处死大鼠取材,采用微波消解及原子吸收分光-石墨炉法测定血铅及脑、心脏、肝脏、肾脏、骨等组织的铅含量。⑤采用RT-PCR法检测海马NMDA受体NR1、NR2A和NR2B亚基mRNA的表达。⑥表面荧光法检测血液锌原卟啉(ZPP)。⑦放射免疫法检测血清甲状旁腺素(PTH)和骨钙素(OC)。⑧化学法检测血钙、镁,微波消解及原子吸收分光-石墨炉法测定骨钙、镁。⑨ELISA检测肝脏、肾脏金属硫蛋白(MT)。结果及讨论:第一部分长期饮用纯净水时慢性铅中毒模型的建立(一)大鼠一般生长状况整个实验期间,大鼠饮食饮水状况正常,体重持续增加。大鼠生长情况良好,且各组大鼠自主活动正常,神经行为未见明显改变,同等染毒剂量不同饮水组间,体重差异无明显变化。(二)血液中铅含量的变化各染铅组大鼠的血铅均高于100μg/L(即1991年美国国家疾病控制中心(CDC)制定的儿童铅中毒诊断标准),其中高剂量组的血铅超过了1000μg/L,超过到了重度铅中毒标准(即美国CDC的Ⅳ级标准450μg/L ~700μg/L)。随着染毒剂量的增加和染毒时间的延长,大鼠的血铅逐渐增加。但在同等染毒剂量下不同饮水方式之间,血铅未见明显差异。(三)血液中钙、镁的含量的变化饮用纯净水对大鼠血钙,血镁的含量无显著影响。(四)血液锌原卟啉的变化ZPP是反映铅血液毒性的早期效应指标。实验结果显示ZPP的含量随染毒剂量升高而升高,并且在同等染毒剂量下饮用纯净水的大鼠其ZPP均高于饮用自来水的大鼠(在低剂量染毒组、不同饮水方式间差异有统计学意义,P<0.05)。血铅及ZPP的升高说明成功建立了大鼠慢性铅中毒的模型。第二部分长期饮用纯净水对铅在机体组织中蓄积的影响(一)心脏、肝脏、肾脏、脑,骨铅含量的比较同等染毒剂量下饮用纯净水的大鼠其上述组织中铅含量均大于饮用自来水的大鼠。其中,在不同饮水方式的对照组(未染铅的自来水组与纯净水组)及低中高三个剂量组中,心脏、肾脏铅含量比较均显示出有统计学意义的差异(P<0.05);在对照组和低中剂量组,肝脏铅含量的差异具有统计学意义(P<0.05);骨骼铅含量具有统计学意义的组别为低中高三个剂量组(P<0.05);脑铅含量在对照组和高剂量组中出现明显差异(P<0.05)。值得注意的是肾脏、肝脏、心脏、脑组织中,在两个对照组中其铅含量也有差异(p<0.05),这就提示在日常的环境暴露情况下,长期饮用纯净水也可能会增加铅在体内的蓄积。(二)骨骼钙镁含量及相关激素(骨钙素和甲状旁腺素)水平的比较铅暴露能够降低血清骨钙素,升高血清甲状旁腺素,并且长期饮用纯净水能够增加这种趋势。虽然各组动物血钙,血镁之间未呈现显著差异,但是骨钙的含量随铅染毒剂量的增高而降低,同等染毒剂量下饮用纯净水的大鼠其骨钙均低于饮用自来水的大鼠,并且在对照、中、高剂量染毒组间差异有统计学意义(P<0.05)。骨镁的变化也呈类似趋势。实验结果说明长期饮用纯净水能干扰大鼠骨骼的钙镁代谢。(三)肝脏、肾脏金属硫蛋白的比较金属硫蛋白是具有很强重金属结合能力的蛋白质,可以加速重金属从体内排除,在重金属解毒中具有重要地位。我们发现随铅染毒剂量的增高,肝脏、肾脏金属硫蛋白的含量也随之增高;并且发现同等染毒剂量下饮用纯净水的大鼠肝脏中金属硫蛋白的含量高于饮用自来水的大鼠。这与饮用纯净水组的大鼠其肝脏铅含量高于引用自来水组的大鼠相一致,提示长期饮用纯净水能引起肝铅蓄积增加,从而刺激肝脏产生更多的MT进行解毒。饮用纯净水导致肾脏MT下降,可能与肾脏中较大铅负荷耗竭MT,并且肾脏不及肝脏具有较强的再生与合成蛋白质的能力所致。第三部分长期饮用纯净水时铅对大鼠学习记忆能力的影响在染毒12周、24周时对大鼠进行了两次水迷宫实验,并检测了大鼠海马NMDA受体NR1亚基、NR2A亚基、NR2B亚基mRNA的表达情况。发现在24周水迷宫实验中,体现大鼠学习能力的定向航行实验显示在低铅(50 mg/L)及中铅剂量(200 mg/L)暴露下,饮用纯净水的大鼠其逃逸潜伏期长于饮用自来水的大鼠(p<0.05)。逐日分析显示,差异主要发生在1~2 d,此后的3~5 d差异消失。此结果提示在相对较低的铅暴露下,饮用纯净水能加重铅所致大鼠学习记忆能力的下降。NR1、NR2A亚基在两种饮水情况下均呈现随着染毒剂量的增高,其mRNA表达逐渐降低的趋势,说明两种饮水中的铅都导致了脑组织中NMDA受体表达的降低,并且在同等铅染毒剂量下,饮用纯净水的大鼠脑组织NR1、NR2A亚基mRNA的表达均低于饮用自来水的大鼠,其中NR2A在两个低铅剂量组之间的差异具有统计学意义(p<0.05)。NR2B亚基mRNA的表达在低、中剂量时有增高的趋势,在高剂量时mRNA的表达降低,考虑为低剂量铅的刺激效应;并且在同等铅染毒剂量下,饮用纯净水的大鼠脑组织NR2B亚基mRNA的表达均低于饮用自来水的大鼠。结合NMDA受体亚基mRNA的表达情况和水迷宫实验的结果,我们推测纯净水能够加重铅所致的NMDA受体NR1、NR2A、NR2B表达下降可能是其影响大鼠的学习记忆能力的机制之一。结论与展望:综上所述,我们发现长期饮用纯净水能增加铅在大鼠实质性组织中的蓄积,加重铅对造血系统的毒性;干扰骨骼钙镁代谢;降低NMDA受体NR1、NR2A、NR2B亚基mRNA的表达,同时迟滞其空间学习记忆能力,在低剂量铅暴露下上述效应更为明显。由于时间的限制,我们的研究还有不完善的地方,比如NMDA受体在蛋白质水平上的验证工作(免疫组化和Western Blot)等。建议今后开展在铅吸收中起重要作用的DMT1在mRNA及蛋白质水平的改变,以及饮用纯净水背景下其它毒物及药物等的代谢状况改变等,以更全面地了解长期饮用纯净水对机体健康的影响。