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本实验室前期克隆了黑曲霉JMU-TS528α-L-鼠李糖苷酶基因,并在毕赤酵母中成功表达且构建了其蛋白质三维结构模型。本论文在此研究的基础上,基于理性设计构建突变体,测定突变体最适温度、最适pH以及温度稳定性,并对热稳定性显著提高的突变体进行圆二色谱、荧光光谱以及分子动力学模拟,解释其热稳定性改变的原因。首先,依据PoPMuSiC预测的突变体折叠自由能的变化,确定了5个突变位点,包括14个突变体,实验证明有6个突变体的热稳定性明显提高,突变位点集中在573位和631位氨基酸。联合突变得到K573V-E631F突变体,其在60°C、65°C、70°C的半衰期与原始型相比,分别提高了2.3 h、16 min、1.3 min。对其结构进行分析推测内部疏水性的增加可能是热稳定性提高的重要因素。通过圆二色谱、荧光光谱和分子动力学模拟发现K573V-E631F突变体α-螺旋、β-转角、无规则卷曲结构增多,三级结构没有明显变化,蛋白质整体波动幅度较小,且α-螺旋附近的氨基酸刚性增加。其次,通过精氨酸替换赖氨酸从而提高热稳定性的策略,选择位于蛋白质表面的赖氨酸位点,并结合Discovery Studio 2016预测分析,设计了5个突变体。实验证明406位、440位、573位的氨基酸突变体热稳定性提高。再进行联合突变得到2个热稳定性提高的双点突变体K406R-K440R和K406R-K573R。K406R-K573R热稳定性提高最多,在60°C、65°C、70°C的半衰期与WT相比,分别提高了3 h、23 min、3.5 min。通过圆二色谱分析发现其二级结构中α-螺旋、β-转角、无规则卷曲结构增多,和突变体K573V-E631F的二级结构比例相差不大,三级结构没有明显变化,分子动力学模拟发现其蛋白质整体波动幅度较小,内部疏水性的改变以及氢键和cation-π相互作用的增加可能是热稳定性提高的原因。最后,在前面两种策略得到的热稳定性提高的突变体进行联合突变,得到2个热稳定性提高的突变体,其中K440R-E631F稳定性提高最多,在60°C、65°C、70°C的半衰期与WT相比,分别提高了3.5 h、25 min、2.7 min,同时通过圆二色谱、荧光光谱以及分子动力学模拟发现K440R-E631F二级结构中α-螺旋、β-转角、无规则卷曲结构增多,与WT、K573V-E631F、K406R-K573R相比,其α-螺旋含量最多,可能与热稳定性的提高有关。