骨髓组织中至少含有两种类型的干细胞：造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)和间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)。骨髓造血微环境为HSC提供生长、发育的场所。造血微环境细胞成分主要由骨髓MSC分化产生的成纤维细胞、脂肪细胞、成骨细胞和内皮细胞等基质细胞构成。基质细胞通过与造血细胞直接接触、分泌细胞外基质及多种细胞因子调控造血，维持造血微环境的结构和功能完整性，实现对造血的精细调控，维持骨髓正常造血。MSC作为造血微环境主要细胞成分的前体细胞(Precursor)，具有自我更新和多向分化特性，在造血微环境和造血调控中发挥重要作用。近年来有报道，MSC与HSC联合移植能够促进HSC的植活率，缩短无髓期，减少死亡率。但目前对MSC与造血调控之间的关系所知甚少。本研究的目的，是探讨MSC是否能在体外调控造血，以及如何调控造血。本研究分为三个部分：一、脐带血造血前体细胞在间充质干细胞微环境中向单核系分化。二、可溶性M-CSF受体(sMR)的克隆、原核表达和功能测定。三、脐带血造血前体细胞在间充质干细胞微环境中的增殖动力学研究。 第一部分的研究中，采用Ficoll密度梯度离心，得到低密度的骨髓单个核细胞，然后利用MSC的粘附特性来分离纯化MSC。实验中观察到原代培养接种的细胞于3～4h后开始贴壁，24h后贴壁细胞数量明显增多，3～4d出现一些集簇，此时，细胞多为梭形。一周后，贴壁细胞体积增大，大部分呈梭形，有些细胞呈三角形或多角形，两周后，细胞铺成单层，排列成漩涡状、网状、辐射状，其形态与成纤维细胞相似。在原代培养中，还观察到一些圆形的造血细胞或内皮细胞贴壁生长，但经过传代培养后，这些细胞不能再次贴壁，贴壁的均为梭形细胞，因此MSC得到纯化。利用流式细胞术检测体外培养的MSC纯度，结果显示，MSC均表达CD29(99.7％)、CD44(99.1％)和CD166(83.2％)，不表达CD34、CD45和HLA-DR，表明培养的细胞为均一的MSC，无造血细胞污染。为证实体外培养的细胞是MSC，须证明其具有多向分化潜能。本研究通过添加成骨培养基和成脂肪培养基，诱导MSC向成骨细胞和脂肪细胞分化。MSC经体外诱导培养三周后，通过RT-PCR技术检测，证明有成骨特异性基因浙江大学博士学位论文 (骨桥蛋白基因)和成脂肪特异性基因(脂蛋白脂肪酶基因)的表达;通过Von Kossa染色，观察到成骨诱导培养后，细胞外基质有大量钙盐沉积，培养四至六周后油红染色，观察到成脂肪诱导培养后，细胞内有大量的脂肪。表明MSC已向成骨细胞和脂肪细胞分化，证实体外培养的细胞是具有多向分化潜能的Msc。 为观察MSC能否在体外调控造血，将脐带血单个核细胞接种到以MSC为饲养层细胞的培养体系中，经过2一3周的共培养，观察到有大量的造血细胞粘附在MSC上生长。流式细胞术检测，发现该类细胞几乎都表达单核系标志CD14(98.4%)，而不表达其它髓系和淋巴系标志:CD15(0.35%，粒系)、CD41(0.91%，巨核系)、glyeoporinA(O，28%，红系)、CD7 (l .15%，T淋巴细胞)和CD19(0 .91%，B淋巴细胞)。说明在本研究的培养条件下，以MSC为饲养层细胞的微环境中，即使不添加外源性造血生长因子，脐带血造血前体细胞能向单核系定向分化。国内外未见有类似的研究报道。此外，还观察到在向单核系分化的过程中，造血细胞粘附在MSC上生长，如果没有MSC饲养层细胞，只用MSC上清液培养时，细胞会逐渐死亡。提示在向单核系定向分化过程中，除了造血生长因子的作用外，细胞与细胞间的相互作用可能也是必须的。 已知与单核系定向分化有关的细胞因子有GM一cSF和M一cSF。为探讨脐带血造血前体细胞在MSC微环境中向单核系定向分化的机制，检测MSC中造血生长因子的表达，发现其能构成性表达SCI子、I了1 t3L和M一CSF，不表达GM一CSF不[IG一CSF。巨噬细胞集落刺激因子(maCroph:，g。CO王ony一Stim。lating factor，M一CS内是一种谱系特异性的造血生长因子，对单核一巨噬细胞的增殖、分化及活性维持有重要作用。M一CSF与巨噬细胞集落刺激因子受体(M一CSF一附结合后，M一CSF一R发生二聚体化，其胞内区的激酶结构域活化，引发一系列的信号传递，从而发挥其生物学效应。M一CSF一R是原癌基因(fms)编码的跨膜蛋白，属于酪氨酸激酶受体家族，其胞外区有5个19样结构域分别称为D1、D2、D3、D4和D5，现已确定M一CSF一尺胞外区5个19样结构域中的前3个Dl一3对M一C舒的结合起直接作用。 为研究MSC微环境中M一CSF对脐带血造血前体细胞增殖和分化的影响，第二部分的实验克隆了M一CSI了一R胞外配体结合区(Dl一3)(可溶性M一CSF受体，sMR)，通过它封闭间充质干细胞分泌的M一CSF，观察其生物学效应。参考文献报道的M一CSF一R基因序列，设计了一对引物，在上游引物中加入了限制性内切酶Ndel的酶切位点，在下游引物中加入了Ba翩I的酶切位点和终止密码子，扩增SMR的基因序列，然后利用TA克隆的方法，将其连接到pUCm一T载体上。通过测序，证实了克隆的DNA序列完全正确。再利用 Nde工和BamHI限制性内切酶分别切割携带有目的基因的pUCm--T/SMR质粒和表达载体