农杆菌介导棉花遗传转化及转phyA植株的获得

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本研究以优良的陆地棉品种冀无2031、中521和农大94-7为受体材料,利用农杆菌介导的方法,将含有根特异性表达启动子的phyA基因转入供试品种的下胚轴中,利用正交设计方法优化了农杆菌侵染棉花下胚轴的转化条件,并获得抗性愈伤组织:将phyA基因导入珂312和珂201的胚性愈伤组织中获得了经PCR检测的转基因植株;以珂312、中521和农大94-7的茎尖分生组织为受体,获得了含phyA基因的T2代植株,进一步对转基因植株的后代进行根系植酸酶活性分析,为棉花现代分子育种增添新的内容和新的种质材料,同时为农作物有效利用土壤有机磷资源开辟一条经济有效的途径。主要研究结果如下:1.通过正交设计方法,研究了农杆菌介导的棉花下胚轴遗传转化过程中菌液浓度、侵染时间、共培养时间和共培养温度对抗性愈伤转化效率的影响。结果表明,四个因素均对抗性愈伤的诱导率有极显著影响,其诱导效应依次是共培养温度>菌液OD值>侵染时间>共培养时间。按照正交设计的原则,最终得到农杆菌介导转化棉花下胚轴的最佳条件是:菌液OD值为0.3,侵染15min,24℃共培养24h。研究了卡那霉素(Km)对棉花愈伤组织诱导和生长的影响,结果表明,不同的品种对Km的敏感性不同,中521愈伤组织的筛选压为150mg/L,冀无2031和农大94-7愈伤组织的筛选压为100mg/L。2.利用优化的条件,以珂312、中521和农大94-7的茎尖分生组织为受体,获得了含phyA基因后代植株,Southern杂交证实外源基因已整合到棉花基因组中。通过对具有Southern斑点杂交信号的6棵T1代和9棵T2代单株进行植酸酶根系活性分析表明T1代和T2代单株根系分泌活性都明显高于未转化的对照单株,是对照的1.32~7.76倍。3.利用优化的条件,将phyA基因导入珂312和珂201的胚性愈伤组织中,获得了经PCR检测的转基因植株。
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