[研究背景]人的子宫内膜是一个激素响应的组织,这个组织在循环的月经周期中有序地增殖、分化、脱落和修复。在每一个月经周期中,这个动态的组织重塑为着床提供一个很短的容受期,这个时期被称为“着床窗”。子宫内膜的一个重要功能是允许胚胎粘附、浸润、诱导基质进入蜕膜化。如果着床失败,内膜将会退化,并随着月经周期而重塑和修复,为下一次的着床窗做准备。当囊胚植入着床点后,着床囊胚陷入子宫内膜的基质床里,然后经过大量分化,血管重塑和免疫细胞的募集,这个过程叫做蜕膜化,是成功着床非常重要的过程。蜕膜组织产生大量分泌因子,在胎盘形成前为发育中的胚胎提供营养并且为胚胎提供了一个免疫耐受的环境。很多研究都证实子宫基质增殖和分化的异常与临床上的反复流产、先兆子痫、宫内生长受限和不明原因性不孕密切相关。尽管有很多信号分子被证实参与调节内膜重塑和和着床的变化过程,但是在月经周期和妊娠早期调节正常内膜功能的分子机制仍然有待进一步研究。泛素化是泛素介导的降解蛋白的过程,但目前越来越多的研究表明泛素化还有介导非蛋白降解的功能,包括DNA损伤修复、信号传导、转录调节、胞吞作用和蛋白激酶活化等。也有更多的证据表明泛素化和许多组织器官的发育和疾病有关。在这方面,以前的研究提示泛素和泛素相关的蛋白在内膜的转换和胎盘的发育中很可能有重要的作用。例如非孕期的内膜基质细胞的泛素含量很低,但是早孕的时候蜕膜基质的胞核和胞浆的泛素水平明显升高。还有研究证明,体外培养的人子宫蜕膜细胞可以分泌泛素。虽然已有很多证据证明泛素和泛素相关蛋白介导的泛素化与早孕期子宫内膜的功能密切相关,但是具体的调节机制依然未阐明。NEDD8 (neural precursor cell-expressed developmentally downregulated 8)是一个76氨基酸的多肽,它可以连接目的蛋白进行类泛素化的修饰,最初的报道是在小鼠胚胎的脑组织中高度富集。在许多类泛素的蛋白中,NEDD8与泛素最类似,并且可以通过一个活性的neddylation的过程,这个过程和泛素化非常类似。NEDD8特异性地与底物蛋白相结合的修饰过程被称为neddylation,这个过程需要的一系列的酶催化级联反应,参与的酶和泛素系统的很类似。这些酶包括NEDD8活化酶E1,它是由APPBP1和UBA3形成的异源二聚体,还有NEDD8结合酶E2 (Ubc12)和可特异性选择底物的NEDD3连接酶E3。与经典的泛素化过程类似,neddylation的过程也包括连接、激活和与底物结合的有序过程。但是将NEDD8结合到底物蛋白的neddylation不是为了蛋白降解,而是改变蛋白的修饰以改变其活性和功能。neddylation过程最著名的底物蛋白是高度保守的cullin家族, cullin蛋白可以组成泛素E3连接酶的骨架结构,Cullin是SCF (SKP1-Cullins-F-box proteins)复合体或SCF类E3连接酶CRL(Cullin-RING ubiquitin ligases)的重要组成分子。这些泛素连接酶的聚合需要cullin neddylation的激活。所以通过调节CRLs, neddylation可以调节许多生理过程,包括胚胎发育和肿瘤发生中的细胞周期和信号转导等过程。Cullins证实在孕早期母胎界面有表达,所以我们对于进一步研究NEDD8介导的neddylation在子宫内膜的增殖和分化中的生理功能有极大的兴趣。在本研究中,我们观察到NEDD8在子宫内膜中随着月经周期广泛而持久第表达,并且通过使用人子宫内膜基质细胞系(T-HESC)和特异性的NEDD8激活酶抑制剂MLN4924,进一步揭示了抑制neddylation可以导致增殖和分化的异常的机制,这些结果都为NEDD8介导neddylation对子宫内膜基质的增殖和分化的必要性提供了新的依据。[研究目的]我们通过研究NEDD8在人子宫内膜和人子宫内膜基质细胞(HESC)中的表达和相关作用,探讨NEDD8介导的neddylation在子宫内膜基质的增殖和蜕膜化中的作用,为进一步研究NEDD8在围着床期子宫内膜容受性中的作用提供一定的理论依据。[材料和方法]1、研究对象收集从2013年1月到2013年5月间就诊于南方医科大学南方医院生殖医学中心的患者共53例。患者月经周期规律,有排卵,无其它生殖系统疾病。收集从增殖早期到分泌晚期的人子宫内膜组织,分别为增殖早期(10例)、增殖晚期(13例)、分泌早期(10例)、分泌中期(10例)和分泌晚期(10例)。3例增殖晚期内膜组织用于提取原代人子宫内膜基质细胞,剩余50例组织用于提取RNA和免疫组织化学染色观察NEDD8在人子宫内膜月经周期的不同时期的表达模式。用永生化的人子宫内膜基质细胞系(T-HESC)分别在增殖和MPA/cAMP诱导的分化状态下观察NEDD8的表达和相关作用研究。2、研究方法用NEDD8激活酶特异性抑制剂MLN4924抑制neddylation,分别观察HESC增殖和分化的异常。首先用MTS和Ki67检测细胞增殖,用流式细胞术分选细胞周期,然后用BrdUpH3分别标记细胞周期的S期和G2/M期。用F-actin首先检测分化状态下细胞微丝骨架结构,然后在HESC中抑制neddylation后检测分化的标志分子PRL、IGFBP1和STAT3的mRNA水平。在明确抑制neddylation会影响HESC的蜕膜化后,我们用蛋白免疫印迹检测发现p21的异常积聚。考虑p21是衰老相关的分子,我们用SA-β-Gal染色标记细胞衰老的数目。最后用p21的特异性siRNA降低异常升高的p21水平,看是否能挽救增殖和分化的异常以进一步研究机制。3、统计学分析数据均以x±s表示,应用SPSS19.0统计软件分析。多因素资料采用析因设计方差分析(two-way ANOVA)。两样本均数比较采用独立样本t检验；多组均数方差齐性,采用单因素方差分析(one-way ANOVA)及LSD两两比较；多组均数方差不齐,采用Welch近似方差分析及Dunnett’s T3两两比较。统计分析中,检验标准为α=0.05。P<0.05认为差异有统计学意义。所有实验除特殊说明外至少重复3次。[结果]1. NEDD8在子宫内膜的基质和上皮中广泛表达,从增殖早期到分泌晚期的腔上皮、腺上皮和基质细胞中均有表达。这种强烈而持久的表达和核定位的表达模式提示NEDD8介导的neddylation在子宫内膜的增殖和分化中可能有重要作用,很有可能参与其动态的调节过程。2. NEDD8在永生化的人子宫内膜基质细胞系(T-HESC)中的增殖期和分泌期均有表达,而且与免疫组化染色结果一样都呈核定位,提示NEDD8在内膜基质中发挥一定的作用,并且用这个细胞系进行基质相关的下一步研究是可行的。3. NEDD8激活酶特异性抑制剂MLN4924可以有效抑制cullin neddylation,并且导致人子宫内膜基质细胞增殖的异常。细胞周期的异常是造成增殖异常的一部分原因,在异常的细胞周期中,抑制neddylation表现为细胞进入S期减少和减缓,并且不进入G2/M期。提示MLN4924抑制neddylation是通过影响细胞周期部分影响HESC的增殖。4. MLN4924抑制neddylation还可以导致人子宫内膜基质细胞分化的异常。表现为细胞微丝骨架的异常,并且使细胞无法进入蜕膜化。5. MLN4924抑制neddylation导致p21水平的异常积聚,由于p21是诱导细胞衰老的分子,所以我们进一步检测了细胞衰老,结果提示增殖和分化状态的HESC中p21增加会使细胞衰老增加,这个结果提示p21的升高可能影响细胞活性从而导致细胞衰老的增加。同时p21是细胞周期中抑制G1期向S期和S期向G2/M期进行的分子,所以异常升高的p21可能通过抑制细胞周期影响细胞的增殖。6.在人子宫内膜基质细胞系(HESC)中用MLN4924抑制neddylation不会导致细胞凋亡,与时间和剂量均不相关,说明细胞增殖的异常不是由于细胞凋亡造成的。7.用p21特异性siRNA降低异常升高的p21的水平可以部分挽救增殖的异常和细胞衰老的增加,但是不能挽救分化的异常。说明增殖的异常部分是由于p21的升高引起的(细胞周期的阻滞和细胞衰老的增加),但是分化的异常有其他机制,有待我们进一步研究。[结论]1. NEDD8在人子宫内膜基质中随着月经周期稳定而持久地表达。2. NEDD8在永生化的人子宫内膜基质细胞系(T-HESC)中增殖期和分化期均有表达。3. MLN4924抑制neddylation可以导致人子宫内膜基质细胞增殖的异常。细胞周期的异常的部分原因,表现为进入S期减少和减缓,并且不进入G2/M期。4. MLN4924抑制neddylation可以导致人子宫内膜基质细胞分化的异常,表现为细胞微丝骨架的异常和细胞无法进入蜕膜化。5. MLN4924抑制neddylation导致p21水平的异常积聚,同时诱导细胞衰老的增加。6.在人子宫内膜基质细胞系(HESC)中抑制neddylation不会导致细胞凋亡。7.降低异常升高的p21水平可以部分挽救增殖的异常和细胞衰老的增加,但是无法挽救分化的异常。