随着现代化工业的发展,铅(Pb)作为一种广泛的化工污染物已经严重危害人类的健康安全。铅暴露会引起机体的免疫功能障碍,导致中性粒细胞的损伤。硒(Se)作为机体必需的微量元素之一,能够拮抗重金属毒性。中性粒细胞外捕网(NETs)是机体发挥免疫功能的方式之一,其形成主要受到髓过氧化物酶(MPO)、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)、呼吸爆发、钙离子等多种因素调控,NETs与其他细胞死亡方式如凋亡、自噬也存在联系。许多研究表明当细胞凋亡增加时,会抑制中性粒细胞外捕网的形成。重金属铅可引发肝细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等发生细胞凋亡。但铅是否会抑制NETs的形成,硒是否能够拮抗铅的毒性及具体机制尚不可知。本研究从海兰褐蛋鸡外周血中分离出中性粒细胞(异嗜性白细胞),根据预试验结果构建体外铅硒暴露模型,分组为NC组(空白组)、Pb组(12.5μM)、Se组(1μM)、Pb+Se组(12.5μM/1μM)。本试验中使用佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)作为NETs形成的诱导剂。通过扫描电子显微镜和Hoechst33258荧光染色,观察中性粒细胞的形态学变化。AO/EB双荧光染色以及Annexin V-FITC-PI流式细胞术检测细胞凋亡,荧光定量PCR(q RTPCR)和免疫印迹(WB)检测线粒体凋亡途径、死亡受体途径相关基因m RNA和蛋白的表达。通过荧光染色检测活性氧水平(ROS)、呼吸爆发、内质网钙离子释放,q RT-PCR和WB检测相关基因m RNA和蛋白的表达,试验结果表明:1.铅抑制由PMA引起的RAF-MEK-ERK-NOX2通路的m RNA表达上升、ERK蛋白的磷酸化及呼吸爆发,之后抑制MPO、NE等蛋白的释放,从而抑制外捕网的形成。硒拮抗了铅的毒性作用,恢复了以及上述通路的表达以及呼吸爆发。2.铅抑制由PMA引起的PLC-IP3R通路m RNA以及蛋白的表达,阻碍内质网中钙离子的外流,从而阻碍外捕网的形成。硒能够拮抗铅的毒性作用,恢复PLC-IP3R通路m RNA和蛋白的表达以及内质网中钙离子的外流,恢复外捕网的形成。3.铅暴露后会引起中性粒细胞凋亡的增加。铅可引起氧化应激,破坏氧化抗氧化系统平衡,并且抑制Bcl-2、Mcl-1的m RNA和蛋白的表达,增加线粒体凋亡通路(P53、Bax、Bak、Cyt-c、Apaf-1、Caspase 9、Caspase 3)和死亡受体通路(Fas、Fadd、Caspase 8)m RNA和蛋白的表达,铅通过以上途径将细胞死亡方式转变,破坏凋亡与外捕网的动态平衡,引起中性粒细胞凋亡,从而抑制外捕网的形成。硒能够逆转上述由铅引起的m RNA和蛋白表达的变化,阻碍凋亡的发生,进而恢复外捕网的释放。综合以上试验结果,铅可阻碍PMA引起的RAF-MEK-ERK-NOX2通路的激活以及随后的呼吸爆发;铅也会阻碍PMA上调的PLC-IP3R通路以及内质网中钙离子的外流,硒拮抗铅的上述毒性作用。此外,铅暴露会引起中性粒细胞氧化应激,激活死亡受体通路和线粒体凋亡通路,随后引起细胞凋亡,硒能够阻碍铅引起的凋亡。本研究结果证明铅是通过引起中性粒细胞凋亡,抑制呼吸爆发和内质网中钙离子的外流,从而抑制中性粒细胞外捕网的形成。硒拮抗铅的毒性作用,恢复外捕网的形成。本研究数据丰富了铅的免疫毒性研究,并为人类铅暴露引起的免疫损伤机制的研究提供一定的参考。