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Combretastatin A-4 (CA-4)是Pettit等人从南非灌木Combretum caffrum中分离得到的一种天然芪类化合物。它能与秋水仙碱位点结合,具有抑制微管蛋白聚合的作用,对多种人源癌细胞(包括多种多药耐药细胞株)都具有较好的增殖抑制作用。磷酸盐CA.-4(Combretastatin A-4-phosphate, CA-4-P)在体内经磷酸酶水解为具有活性的CA-4。CA-4-P可以在1/10 MTD剂量下显著降低肿瘤血流量,导致大面积肿瘤组织坏死,现在已进入Ⅲ期临床研究。CA-4是顺式均二苯乙烯类化合物,在体内容易形成反式异构体而失活；并且它水溶性差,生物利用度低。依据构效关系,为防止CA-4反式异构化,本课题组用噻吩环将双烯键取代,合成了一系列化合物,并对其抗肿瘤活性进行了评价,发现其中3位羟基被氨基取代的化合物具有较好的抗肿瘤活性,我们将其命名为DAT-230。本文主要研究了DAT-230对人成纤维肉瘤HT-1080和人胃腺癌SGC-7901的抗肿瘤作用及机制。DAT-230对12株人源肿瘤细胞都具有较好的增殖抑制作用。在分子水平,微管聚合试管试验结果表明DAT-230可以抑制微管蛋白聚合。在HT-1080细胞中,免疫荧光试验结果表明DAT-230诱导细胞内聚合状态微管含量降低；细胞内解聚状态微管与总微管免疫印迹实验结果也表明DAT-230诱导细胞内解聚状态微管含量增加。这些都说明DAT-230具有抑制微管聚合作用。PI单染-流式细胞术分析结果表明,DAT-230诱导HT-1080细胞G2/M期周期阻滞具有时间和剂量依赖性,并且诱导细胞凋亡发生在G2/M期周期阻滞后。免疫印迹结果表明DAT-230诱导的G2/M期周期阻滞与周期蛋白密切相关：DAT-230诱导的G2/M期周期阻滞伴随Cyclin B1表达升高；磷酸化p-14/15-cdc2表达水平降低,而cdc2表达水平变化不明显,这说明cdc2的去磷酸化水平增高,即cdc2激活；二者说明Cyclin B1-cdc2复合物激活,即DAT-230诱导HT-1080细胞周期阻滞在M期。而且DAT-230还诱导HT-1080细胞形成异常纺锤体,也说明DAT-230诱导M期阻滞。AV-PI双染-流式细胞术分析结果表明,DAT-230诱导HT-1080细胞凋亡,而且DAT-230诱导的细胞凋亡伴随线粒体膜电位下降,细胞内NO水平升高,Bcl-2/Bax比率降低,Casepase-3、Casepase-9激活和PARP裂解。在人纤维肉瘤HT-1080移植瘤模型中,DAT-230可抑制移植瘤生长,降低肿瘤组织血流量,继而诱导肿瘤组织大面积坏死。在SGC-7901细胞中,DAT-230可以时间和剂量依赖性的抑制SGC-7901细胞增殖,诱导G2/M期周期阻滞。免疫荧光-激光共聚焦结果表明,DAT-230诱导SGC-7901细胞内聚合状态微管含量降低,有丝分裂异常(形成异常单极纺锤体,阻止细胞完成有丝分裂)。蛋白免疫印迹结果表明DAT-230诱导SGC-7901细胞有丝分裂阻滞与细胞周期蛋白密切相关：Cyclin B1蛋白表达升高,磷酸化p-cdc2 14/15表达水平降低,而cdc2表达水平变化不明显,说明cdc2的去磷酸化水平增高。免疫荧光-激光共聚焦结果也表明Cyclin B1转位至细胞核。这些都说明DAT-230诱导SGC-7901细胞周期阻滞在M期。DAT-230诱导SGC-7901细胞凋亡发生在有丝分裂阻滞之后,并伴随线粒体膜电位下降,Cytocrome-c释放,下调Bcl-2蛋白表达,上调Bax蛋白表达,Caspas-3、Caspase-9激活和PARP蛋白裂解。综上所述,本文首次对噻吩取代类双烯键的CA-4衍生物的抗肿瘤作用进行了筛选,并对抗肿瘤作用较好的DAT-230进行了抗肿瘤作用及机制研究。研究发现,DAT-230在分子水平和细胞水平(HT-1080细胞和SGC-7901细胞)都具有抑制微管聚合作用。在体外DAT-230对人成纤维肉瘤HT-1080较正常人真皮纤维细胞HDF-α的细胞增殖抑制作用更强;在体内可以抑制HT-1080裸鼠移植瘤生长,降低肿瘤组织血流量,诱导肿瘤组织大面积坏死。DAT-230诱导HT-1080细胞和SGC-7901细胞有丝分裂阻滞与其破坏细胞内纺锤体微管和调节细胞周期蛋白水平密切相关。DAT-230在这两株细胞中诱导的细胞凋亡发生在周期阻滞之后,线粒体凋亡途径参与其诱导的凋亡。本文不仅为CA-4类化合物的结构改造提供了方向,还为该化合物抗肿瘤作用的进一步研究奠定了基础。