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慢性髓细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一种起源于造血干细胞的骨髓增殖性肿瘤,其主要特征是9号染色体和22号染色体发生平衡易位形成bcr-abl融合基因。该融合基因编码的具有强烈的酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合蛋白,能持续激活下游JAK-STAT,MEK-EKR,CRKL等细胞信号转导通路,促进细胞的快速增殖并抑制其凋亡,从而发生恶性转化。目前,临床上主要使用酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors,TKIs)来治疗CML并且取得了良好的治疗效果。但是,仍然有部分病人对TKIs不敏感或产生耐药。同时,CML的白血病干细胞(leukemia stem cells,LSCs)对TKIs的不敏感成为了CML复发的一个重要原因。因此,亟需探索新的治疗策略,使其对TKIs耐药和CML复发病人同样有效。基因编辑技术为我们提供了一个破坏bcr-abl从而清除CML致病根源的可能。本课题中采用的基于CRSPR/Cas9的RNA引导的Fok I核酸酶(RNA guided Fok I nuleuases,RFNs)技术既具有可变靶位点的灵活性,又具有切割特异性,非常适合用于CML细胞的基因编辑。在本研究中,我们针对bcr-abl基因设计并构建了多个靶向bcr-abl的g RNA,并筛选出效应最佳的作用位点。同时,我们通过同源定向修复(homology-directed repair,HDR)将含有8个碱基的Not I酶切位点成功插入到bcr-abl基因中,使其发生框移突变,提前遇到终止密码子,最终导致BCR-ABL蛋白翻译的提前终止。本课题初步探索了RFNs能否成功破坏bcr-abl融合基因,同时探究了RFNs作用于bcr-abl基因后对BCR-ABL蛋白表达及其下游效应分子活化的影响和机制,以及对CML细胞和CML干/祖细胞增殖和凋亡的影响,最后在小鼠CML血液瘤模型中探索了RFNs对K562/G01细胞致白血病能力的影响。采取的研究方法主要有:1.g RNA表达质粒和donor的设计与构建及其对bcr-abl的破坏作用。在Zi Fi T网页根据bcr-abl基因组序列设计g RNA靶位点,构建相应的g RNA表达质粒。同时,根据靶位点构建含有同源臂的donor,并在donor中插入8个碱基Not I酶切位点。将RFNs+donor电转入K562细胞中,通过免疫荧光,T7E1酶切和Not I酶切以及Sanger测序分析RFNs对bcr-abl的破坏作用。将RFNs+donor电转入K562和K562/G01细胞,分析RFNs对伊马替尼敏感和耐药细胞株中BCR-ABL蛋白和下游效应分子表达的影响。2.RFNs对慢性髓细胞白血病细胞增殖和凋亡的影响及其机制。将g RNA-17+donor,RFNs-half+donor,RFNs+donor各组质粒分别电转K562、K562/G01细胞和bcr-abl阴性的U937、HL60、AD293细胞及CML干/祖细胞和bcr-abl阴性的干/祖细胞。通过克隆形成实验和CCK-8实验检测RFNs对细胞增殖的影响;DAPI染色和FCM检测RFNs对细胞凋亡的作用;western blot检测PARP和Caspase-3的激活情况。3.RFNs对K562/G01细胞在小鼠体内致病能力的影响。将g RNA-17+donor、RFNs-half+donor和RFNs+donor各组质粒分别转染K562/G01细胞,以未处理的K562/G01细胞为阴性对照(wild type),将各组细胞通过尾静脉注射入NOD-SCID小鼠,构建血液瘤模型。通过小鼠生存状态、外周血白细胞计数、CD45+细胞比率、骨髓细胞学检查、肝脾大小和重量、生存时间等参数判断各组小鼠发病情况。通过组织病理学检查和免疫荧光实验检测BCR-ABL蛋白表达情况评估各组小鼠肝脾等组织浸润情况。取得的实验结果和结论如下:1.成功构建靶向bcr-abl的g RNA表达质粒。Western blot结果显示g RNA-17结合的位点效应最明显,作用于该位点的RFNs能有效切割bcr-abl,使其发生双链断裂。将RFNs+donor电转入K562细胞能够有效插入Not I酶切位点,使bcr-abl基因发生框移突变,在下游提前遇到终止密码子,从而终止BCR-ABL蛋白的翻译,BCR-ABL蛋白表达下调,下游的效应分子的活化也相应受到抑制。2.RFNs+donor转染K562和K562/G01细胞后,能抑制细胞增殖并促进其凋亡,在U937、HL60和AD393细胞中则无此效应。将RFNs+donor转染CML的干/祖细胞中也同样能抑制细胞增殖并促进凋亡,而对bcr-abl阴性干/祖细胞则无此作用。说明RFNs能靶向bcr-abl阳性的细胞,且并不影响bcr-abl阴性细胞的增殖。3.RFNs+donor组小鼠外周血白细胞平均计数,CD45+细胞比率,肝脾大小和重量均低于wild type,g RNA-17+donor,RFNs-half+donor组,且改组小鼠获得了更长的生存时间,肝脾浸润情况得到改善,说明RFNs+donor能使K562/G01细胞在小鼠体内的致白血病能力受损。综上所述,我们成功构建了能靶向并有效切割bcr-abl基因的RFNs,并且通过HDR的方式将外源模板中的Not I酶切位点成功插入bcr-abl基因,使其发生框移突变,提前终止BCR-ABL的翻译。该方法靶向破坏了bcr-abl基因,从而清除了CML的致病根源。本课题首次将RFNs引入CML的基因治疗中,为TKIs耐药患者或CML复发病人提供了一种新的治疗策略。