结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)引起的一种感染性疾病，长期危害人类的健康。据世界卫生组织(WHO)2015年公布的全球结核病报告中显示，2014年在全球范围内有150万人死于结核病，估算全年新增结核病病例960万。虽然全球结核病发病率自2000年以来有所下降，但其仍然是最严重的公共卫生威胁之一。到目前为止，卡介苗仍然是世界卫生组织唯一批准使用的结核病预防用疫苗，但其对成人的保护力不佳，因此研发新型的结核病疫苗逐渐成为近年来各国学者研究的重点。本科室前期将Ag85b、ESAT6-CFP10融合蛋白（EC蛋白）与铝佐剂和PolyIC佐剂配伍组成的新型结核亚单位疫苗AEC/Al+PolyIC并对该亚单位疫苗的免疫原性、对结核感染的预防作用及对结核潜伏感染的治疗作用进行了评价，发现该疫苗可在小鼠体内诱导较高的细胞及体液免疫应答，可作为候选疫苗进行其他方面的研究。然而一支合格的疫苗，应是在其生命周期内具有稳定的有效性及安全性，在疫苗的研究过程中，不仅要考虑其有效性的问题，还要对稳定性和安全性做出研究，因此，疫苗的安全性及稳定性同样是考核疫苗质量的关键。由于疫苗本身特性的原因，决定了其性质易受外界条件等诸多因素的影响，而温度的影响作用尤为显著，任何一种疫苗都有其最适的保存温度，在该温度条件下保存一定时间，疫苗的免疫原性等性状不发上明显的改变，且不会引起不良反应。本文建立了疫苗免疫评价用小鼠模型，并根据结核亚单位疫苗候选苗AEC/Al+PolyIC的组分特性，选取适宜的疫苗安全性及稳定性评价方法，将AEC/Al+PolyIC疫苗参考品保存于不同温度下，通过小鼠免疫模型研究组织样本内过敏介质的含量及细胞免疫应答和体液免疫应答水平，衡量温度对该疫苗参考品安全性及稳定性的影响。　　本研究主要内容包括：⑴建立了免疫毒理学评价用小鼠模型，并用耻垢疫苗及重组结核疫苗参考品(AEC/Al+ PolyIC)进行验证，模型组各项评价指标显著高于对照组和耻垢疫苗组及疫苗参考品组，显示血清过敏抗体IgE、过敏介质组胺和白三烯可以用作疫苗免疫毒性的评价指标。⑵用不同条件下保存的疫苗参考品免疫小鼠，对其免疫毒性进行评价。将实验小鼠分为冷藏组、冻存组与现配组，参考品于4℃和-70℃存放1、6、12月后经小鼠后肢内侧肌肉注射，共免疫三次，每次间隔一周，末次免疫后一周，收集腹腔灌洗液、气管刺激物及外周抗凝血浆，检测过敏介质含量，比较一年内各项过敏介质指标与新鲜配制的疫苗参考品的区别。以现配组为基准，用实验组各项指标检测结果与现配组的比值衡量参考品免疫原性的变化，结果发现，4℃及-70℃条件下疫苗参考品保存一年时间内，与现配组参考品相比免疫毒性均不发生明显改变，并且与PBS组无差别，样本组胺、白三烯相对含量在0.9-1.0左右浮动，且保存一年后样本两检测指标相对含量与第一月相比差异均不显著(P＞0.05)。证明无论在4℃还是-70℃条件下保存，疫苗参考品安全性一年时间内未发生明显改变。⑶用不同条件下保存的疫苗参考品免疫小鼠，对其免疫原性进行评价。将将实验小鼠分为冷藏组、冻存组与现配组，参考品于4℃和-70℃存放1、6、9、12月后经小鼠后肢内侧肌肉注射，共免疫三次，每次间隔十天，末次免疫后十天，摘眼球采血，分离血清，无菌取脾，分离脾淋巴细胞，采用ELISA法检测血清Ag85b蛋白和EC蛋白特异性IgG抗体效价，采用ELISPOT法检测抗原特异性IL-2和IFN-γ脾淋巴细胞，采用改良MTT法检测脾淋巴细胞增殖指数。比较一年内各项评价指标与新鲜配制的疫苗参考品的区别。以现配组为基准，用实验组各项指标检测结果与现配组的比值衡量参考品免疫原性的变化，结果显示，4℃条件下保存参考品的各项细胞免疫评价指标相对值均下降，第9月时相对水平显著低于第1月，EC特异性IL-2、IFN-γ相对水平第6月与第1月相比差异显著;-70℃条件下保存参考品的各项细胞免疫水平与第1月相比其他各月没有显著下降;抗体效价结果显示，无论4℃还是-70℃条件下保存，体液免疫均稳定维持在较高水平，各月间未见显著差异（P＞0.05）。4℃条件下保存，参考品诱导的细胞免疫水平明显下降，体液免疫水平相对稳定;-70℃保存12个月，该参考品细胞及体液免疫原性没有明显降低，与-70℃相比4℃不适合作为该参考品长期保存的条件。