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杜氏盐藻(Dunaliella sallina)是一种光自养单细胞、无纤维质细胞壁的真核绿藻,能高水平合成β-胡萝卜素和油脂,是生产天然β-胡萝卜素和优质生物燃料的良好原料。特别是盐藻能在高盐环境下正常生长,大规模养殖不易发生病虫等污染,已成为现代农业中一种重要的特用生物资源。构建盐藻高效遗传转化体系并对目标基因进行精准修饰,可加快具突破性状盐藻优异种质的定向培育,促进建立以遗传改造的盐藻工程株系为平台生产高附加值特定化学品的绿色产业体系。为此,本研究以杜氏盐藻YC-011藻株为受体,以参与三酰甘油(TAG)生物合成的两个重要酶基因DGAT1a和GPAT为靶标,系统优化电击和基因枪遗传转化体系;分别将两个外源靶基因导入盐藻细胞并使其有效表达,以期修饰藻细胞TAG合成途径,进而培育富油盐藻优异工程株系。主要研究结果如下:1.细胞形态学和18SrDNA分子鉴定证实先期从山西运城盐湖分离获得的盐藻藻株YC-011 为杜氏盐藻(Dunaliella sallina)一个新株系。2.应用50μg/mL氯霉素、100μg/mL氨芐青霉素和100μg/mL头孢霉素组合,经3次除菌处理和5次继代培养,建立了杜氏盐藻无菌培养体系。3.针对表达载体携带抗除草剂草铵膦筛选标记(BAR基因),通过定量检测盐藻细胞对草铵膦的敏感性,确定固体和液体培养筛选阳性转化体的草铵膦浓度分别为20 μg/mL和 40 μg/mL。4.建立了优化的盐藻电击遗传转化体系:培养7天的盐藻细胞为最适受体,质粒浓度6μg/mL,电击参数为0.4kv和4ms。盐藻转化率达2.63%。,比现有电击转化效率提高约1.14 倍。5.建立了优化的盐藻基因枪遗传转化体系:以培养7天的盐藻细胞为受体,在靶距为6 cm、轰击压力为1300psi条件下进行1次轰击,转化效率达0.13‰。6.来源于高油植物斑鸠菊(Vernonia galamensis)的VgDT1a cDNA克隆编码催化TAG合成最后一步酰化反应的二酰甘油酰基转移酶(DGAT1a)。来源于模式微藻莱菌衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CrGPAT cDNA克隆编码甘油-3-磷酸酰基转移酶(CrGPAT),它是磷脂酰甘油生物合成过程中的第一个酰基酯化酶。本文成功构建了分别表达CrGPAT和VgDGAAT1a的表达载体。7.GUS检测和其他分子检测显示,靶基因VgDGAT1a和CrGPAT已成功转入杜氏盐藻受体细胞并高效表达。8.生理生化分析表明,野生型盐藻油脂含量为15.3%,而转VgDGAT1a和CrGPAT基因盐藻油脂含量分别达36.9%和34.8%。可见,这两个限速酶基因的超表达能提高藻细胞贮藏油脂的合成积累。特别是油脂含量提高,并未引起蛋白和类胡萝卜素含量减低及其他不利表型。这些研究结果可应用于微藻高效遗传转化体系的研发、油脂等代谢途径的基因修饰和可编程控制产物合成积累的新型微藻的遗传构建。