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牛病毒性腹泻-粘膜病病毒（Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus，BVDV）是黄病毒科、瘟病毒属（Flaviviridae Pestivirus）的代表种，主要引起牛的病毒性腹泻-粘膜病（BVD-MD），表现为腹泻，急、慢性粘膜病，持续性感染与免疫耐受，免疫抑制，母畜流产、死胎和畸胎等。该病呈世界范围分布，严重危害养牛业的发展。BVDV P20和P14基因位于基因组的5’端，分别编码病毒的非结构蛋白——自体蛋白酶蛋白和结构蛋白核心蛋白，核心蛋白P14具有抗原性，而自体蛋白酶P20的抗原性尚未见报道。为了辅助基因工程亚单位疫苗的应用，本研究克隆BVDV P20和P14基因，并将其在原核系统中表达，旨在为基因工程诊断抗原的研究奠定基础，同时为P20蛋白抗原性的阐述作一必要铺垫。根据GenBank中BVDV Oregon C24V株基因组序列设计二对引物，应用RT-巢式PCR（RT-nested PCR）方法体外扩增BVDV Osloss-Like株P20基因，将其克隆至pMD18-T载体，序列测定及同源性分析表明，BVDV Osloss-Like株P20基因与BVDV VEDEVAC（AJ585412）、Osloss（M96687）、Oregon C24V（AF091605）、SD1（M96751）及NADL（AJ133738）株核苷酸同源性分别为99.21%、93.65%、80.95%、79.96%、78.97%。根据这一结果，参考GenBank上发表的BVDV Osloss株基因组序列设计一对引物，扩增P14基因，并进行序列测定及同源性分析，结果表明BVDV Osloss-Like株P14基因与BVDV VEDEVAC（AJ585412）、Osloss（M96687）、SD1（M96751）、Oregon C24V（AF091605）及NADL（AJ133738）株核苷酸同源性分别为98.37%、94.77%、82.53%、79.41%、78.76%。系统发生分析结果表明BVDV Osolss-Like株P20和P14基因与VEDEVAC株亲源关系较近。利用DNA重组技术，将BVDV P20和P14基因各分别亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1和pPROEX-HTb，构建P20和P14基因重组原核表达载体pGEX-6P-P20、pPROEX-HTb-P20、pGEX-6P-P14及pPROEX-HTb-P14。将上述重组质粒转化至工程菌，在IPTG诱导下重组质粒pGEX-6P-P20和pPROEX-HTb-P20得到高效表达，重组质粒pGEX-6P-P14表达量低，而重组质粒pPROEX-HTb-P14未见有明显表达。因此分别对重组质粒pGEX-6P-P14及pPROEX-HTb-P14的表达条件进行探索，根据结果推测BVDV Osloss-Like株P14基因表达的蛋白可能是一种毒性蛋白，其对大肠杆菌BL21（DE3）pLysS和DH5α具有毒性。