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生长素响应因子(Auxin response factor,ARF)作为一类转录因子,通过调控下游基因表达参与植物诸多生理生化进程。而ARF的转录水平却受miRNA的调控。基于前人和课题组的研究基础,初步明确了番茄miRNA160可调控靶基因SIARF10、SIARF16和SIARF17,miRNA167可调控slARF6和slARF8。本研究为进一步明确miRNA160和miRNA167调控靶基因AREs参与番茄生长发育的功能,利用35S::mSIARF10-6(抗miRNA160降解的形式)转基因材料探讨了miRNA160调控SIARF10对番茄叶片失水速率的影响,并明确了ARF10通过直接影响气孔发育和水通道蛋白表达而增加番茄叶片的水分导度；而利用dgt,gib-3突变体研究了ARFs/miRNAs在番茄果实发育早期果皮发育的作用,初步探讨了受miRNA160和miRNA167调控的ARFs可能协同生长素和赤霉素调控果皮的细胞分裂和膨大：根据构建并获得的超表达miRNA160的转基因植株及T1代,初步发现miRNA160调控的ARFs对番茄叶片有重要的调控作用。这些研究将为进一步明确ARF/miRNA的生物学调控机制和生长素调控植物生长发育的作用机理奠定基础。主要研究结果如下：1.采用mSIARF10过表达转基因番茄(抗miR160降解)叶片进行表型分析发现,其叶片显著变窄(长/宽),气孔变大,气孔密度变小。通常窄叶片具有较小的失水速率,然而与野生型相比,35S:mSIARF10-6的离体叶片表现出更大的叶片失水速率。在水分胁迫处理过程中,35S:mSIARF10-6积累了更高的ABA含量,而对于外源ABA影响其气孔的敏感度显著高于野生型。但进一步分析表明35S:mSIARF10-6实际的叶片失水率与依靠气孔水蒸气散失的计算失水率不同,这表明了还有其他方式影响35S:mSIARF10-6叶片失水。进一步利用水通道蛋白(aquaporins,AQPs)抑制剂HgCl2处理证实35S:mSIARF10-6有较高的AQP活性,具有更高的水力导度。以上结果表明35S:mSIARF10-6失水率的提高是气孔和水通道蛋白活性共同作用的结果。2.根据RNA-sequencing表明在35S:mSIARF10-6中有5个AQP家族基因,14个ABA合成与信号转导相关基因以及3个气孔发育相关基因表达水平发生显著变化,其中SIABI5具有ABA依赖的转录因子活性。对上调表达的AQP基因的启动子分析表明,上调的AQP基因启动子均包含ABRE或AuxRE启动子元件。挑选上调表达最显著的三个基因(SITIP1-1,SIPIP2;4和SINIP-type like)进行启动子活性分析试验发现,包含AuxRE元件的SIPIP2;4和SINIP-like的启动子区域以及包含ABRE元件的SIPIP2;4和SITIP1;1启动子区域在35S:mSIARF10-6转基因材料中GUS酶活性显著增强。EMSA和酵母单杂交试验证实,SIARF10可以与AQP基因启动子中的AuxRE启动子元件结合。而将35S:mSIARF10-6中表达量显著提高的转录因子SIAB15进行酵母单杂交,证实可与AQP基因启动子中的ABRE启动子元件结合。因此35S:mSIARF10-6的AQP表达增强可能是ARF10和ABI5上调表达的结果。然而,通过SIARF10沉默与SIABI5超表达的瞬时表达发现,下调SIARF10可以降低番茄叶片失水率,超表达SIABI5在水分胁迫处理前6h显著下调失水率,因此35S:mSIARF10-6的高失水率不是由于SIABI5的作用,而是SIARF10直接作用的结果。本研究表明,尽管SIARF10通过增加ABA合成与信号响应通过调控气孔开度来降低水分缺失,但SIARF10通过影响气孔发育和水通道蛋白活性来加速水分散失。因此miR160调控的SIARF10对于维持叶片的水分平衡有着重要意义。3.利用外源IAA喷施番茄GA缺失突变体(gib-3)以及外源GA喷施番茄IAA信号途径受阻突变体(dgt)果实材料。解剖结果表明IAA导致果皮增厚,果皮细胞层数增加,而GA并没有增加果皮细胞层数；RT-PCR研究发现,IAA处理gib-3突变体后SIARF6,SIARF8,SIARF10和SIARF16表达水平显著下调,而miR160和miRl67显著上调；而dgt突变体中SIARF6,SIARF8,SIARF10和SIARF16表达水平受到GA影响显著上调,而miRNAs表达水平显著下调。这些结果表明了在番茄果实发育初期,SIARF6, SIARF8,SIARF10和SIARF16的表达与果皮细胞层数呈负相关。进一步利用35S:mSIARF10-6转基因番茄植株进行果实果皮分析,结果表明mSIARF10过表达使坐果期果皮细胞层数显著降低。以上结果表明GA和IAA介导的miRNAs及其靶基因ARFs可能参与番茄果实发育早期的果皮细胞增殖过程。4.利用Gateway技术成功构建了miRNA160超表达载体。将番茄miRNA160前体连入具有强启动子的pB7WG2D,1载体。通过优化的番茄遗传转化体系成功获得番茄转基因植株。并通过荧光检测,分子及蛋白水平等鉴定方法成功验证了T1代转基因植株番茄。对转基因番茄植株进行表型分析,发现35S::SImiR160转基因植株的表型：叶片宽度增大,叶裂减少,叶面积增大等。暗示了miR160对番茄叶片发育的重要调控作用。为一进步探究miRNA160对番茄的生长发育机制提供了优良试材。