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[目的]基于干细胞的骨组织工程是具有应用前景的骨再生方式。其中,干细胞在骨再生过程中具有关键作用。但由于负载在支架材料上的干细胞在植入体内后存活率较低,常导致组织工程骨在体内无法取得理想的骨再生效果。为使干细胞在植入体内后能维持活性并参与局部骨再生,本实验尝试利用生物相容性较好的丝蛋白水凝胶材料(Silk hydrogel)定量负载大鼠骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)并复合于多孔丝蛋白支架上用于大鼠颅骨缺损的修复。期望这一策略能有效维持干细胞在体内的生物学活性及功能并取得较好的骨再生效果,为骨组织工程植入体内后细胞存活率较低的问题提供新的思路。[材料与方法]1.对多孔丝蛋白支架材料进行表征鉴定。制备丝蛋白水凝胶/支架复合物,评价其对营养物质的渗透能力。2.将大鼠骨髓间充质干细胞分别以1.0×10~5/mL、1.0×10~6/mL,1.0×10~7/mL的密度预混于成胶前的丝蛋白水凝胶中,在体外观察干细胞在水凝胶内的分布情况,MTT实验检测各组细胞增殖能力的差异,碱性磷酸酶染色、钙离子浓度测试及RT-PCR实验评价各组细胞成骨向分化能力。3.将携带不同密度细胞的三组丝蛋白水凝胶滴注于多孔丝蛋白支架上,植入大鼠颅骨缺损中,Micro CT、苦味酸品红染色检测各组骨缺损修复情况。Dil细胞体内示踪实验评价所负载细胞植入体内8周后的存活及参与骨形成情况。[结果]1.多孔丝蛋白支架为内部穿通的多孔结构。丝蛋白水凝胶/支架复合物对蛋白大分子及小分子物质均具有较好的渗透能力。2.荧光显微镜下观察可见各组骨髓间充质干细胞均匀地分布在丝蛋白水凝胶之中。MTT细胞增殖能力实验显示各组丝蛋白水凝胶中的骨髓间充质干细胞在体外培养10天后,活细胞数量稳定增加。在成骨能力方面,1.0×10~7/mL组负载细胞丝蛋白水凝胶在体外表现出最强的碱性磷酸酶活性和最高浓度的钙离子沉积。RT-PCR实验显示1.0×10~7/mL组细胞具有最强的成骨向分化能力。3.检测大鼠颅骨缺损区骨再生效果,结果显示1.0×10~7/mL组具有最多的骨小梁结构和最高的新生骨体积。Dil细胞示踪实验显示细胞在植入体内8周后仍然存活并积极参与到骨形成过程中。[结论]将负载细胞的丝蛋白水凝胶与多孔丝蛋白支架复合的策略可以有效维持所负载干细胞在植入体内后的生物学活性,支持干细胞参与局部骨再生。在体外预矿化7天后的负载1.0×10~7/mL密度干细胞的丝蛋白水凝胶/支架复合物在植入体内后,可在缺损部位各处形成均一的骨小梁结构,获得了较好的骨再生效果。