猪流感（Swine influenza，SI）是由A型流感病毒引起的一种急性、热性、高度接触性的猪呼吸系统传染病，临床上表现为突发高热、咳嗽、流鼻涕、呼吸困难、衰竭或死亡。目前在猪群中流行的流感病毒亚型主要是H1N1和H3N2亚型，H1N1亚型自1918年发现至今，在全世界猪群中普遍存在和广泛流行，给养猪业造成了巨大的经济损失，并且对人类健康也构成了严重的威胁，因此对猪H1N1亚型流感的防制不仅具有兽医学意义，而且具有重要的公共卫生学意义。预防和控制流感最有效的方法是接种流感疫苗。由于目前国内尚无猪H1N1流感疫苗，因此本研究试图建立表达猪H1N1亚型流感病毒HA基因重组慢病毒表达系统，包装出表达具有活性HA的重组慢病毒，将此重组慢病毒作为载体疫苗免疫动物，可持续地在体内表达具有活性的HA蛋白，从而诱导机体产生有效的体液、细胞免疫应答与针对猪流感病毒的免疫保护力，评价该重组慢病毒作为疫苗免疫的整体效果，为今后猪流感防控提供理论和实验依据。生物体内的亮氨酸拉链结构有利于蛋白形成稳定的二聚体，其主要代表是酵母转录激活因子GCN4，将亮氨酸变为异亮氨酸形成异亮氨酸拉链结构，可以使蛋白形成三聚体，提高其生物学活性。因此，本课题利用异亮氨酸拉链结构（简称GCN4）来帮助HA更好地形成三聚体，提高其抗原活性。首先，扩增与鉴定HA基因，将HA基因与GCN4基因串联后连入慢病毒表达载体，根据慢病毒蛋白表达系统将重组慢病毒表达质粒、包装质粒与包膜质粒共转染293T细胞包装出重组慢病毒，然后利用293T细胞转导法与RT-PCR法鉴定重组慢病毒是否包装成功，并且利用SDS-PAGE和Western blot分析目的蛋白在293T细胞中的表达，最后利用BS3交联法处理镍柱纯化的HA蛋白，再以Western blot鉴定HA的三聚体活性。结果表明，扩增的HA基因序列正确；连入慢病毒表达载体后经酶切鉴定正确；重组慢病毒转导细胞后荧光显微镜下发现有多量的发绿色荧光的细胞，HA基因的mRNA能在感染的细胞内进行转录，说明包装出了重组慢病毒，滴度分别为重组慢病毒rLV-HA-GCN4组1.1×10~6TU/mL、重组慢病毒rLV-HA组2×10~6TU/mL、LV空载体对照组1.3×10~8TU/mL；SDS-PAGE条带大小正确，说明包装产生的重组慢病毒转导细胞后能稳定表达HA-GCN4，蛋白大小约为67KDa，Western blot鉴定HA-GCN4与其抗体能有效结合，说明表达的HA-GCN4具有良好的反应原性；HA蛋白含有单聚体、二聚体与三聚体三种形式，条带大小分别约为57kDa、114kDa与171kDa，HA-GCN4蛋白只包含三聚体形式，条带大小约为181KDa，说明GCN4能促使HA形成三聚体。将BALB/c小鼠随机分为4组：重组慢病毒rLV-HA-GCN4组、重组慢病毒rLV-HA组、LV空载体对照组与PBS对照组。以体重变化、脾肺指数、体液与细胞免疫水平分别评价重组慢病毒对BALB/c小鼠的免疫原性及对攻毒小鼠的免疫保护效果。每天监测免疫与攻毒后小鼠的体重变化；剖检后计算脾肺指数；ELISA检测免疫与攻毒后小鼠血清中HA特异性IgG抗体效价；FACS检测免疫与攻毒后小鼠的淋巴细胞转化能力、T细胞亚型分类与细胞因子表达。结果表明，两个重组慢病毒免疫组小鼠与PBS组比较，在攻毒前体重差异不显著，攻毒后体重在前3天略有减少，随后显著上升，且与PBS组比较差异显著（P<0.05），说明攻毒对两个重组慢病毒免疫组小鼠体重无影响；攻毒后rLV-HA-GCN4组小鼠的脾肺指数小于PBS组且差异显著（P<0.05），说明重组慢病毒对脾肺能产生保护作用；rLV-HA-GCN4组小鼠在攻毒前的HA抗体效价可达1:8000，攻毒后约为1:7000；重组慢病毒能激活小鼠的脾脏淋巴细胞，rLV-HA-GCN4组的转化率为0.3±0.11，攻毒后重组慢病毒免疫小鼠的脾脏淋巴细胞激活被抑制，但其致敏淋巴细胞数量仍远远大于对照组，且差异极显著（P<0.01）；重组慢病毒能引起机体产生以CD4~+T细胞为主的T淋巴细胞反应，rLV-HA-GCN4组CD4~+T细胞百分含量为38.27±3.32，与PBS组比较差异极显著（P<0.01），攻毒后rLV-HA-GCN4组的CD4~+T细胞的百分含量有所下降但CD8+T细胞的百分含量增加为20.9±0.98，与PBS组比较差异显著（P<0.05）；重组慢病毒引起小鼠机体内各细胞因子的表达量都分别多于PBS组，rLV-HA-GCN4组IL-12、IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-4的表达量分别为4.37±0.52、5.83±0.46、5.67±0.23、1.8±0.15、2.87±0.31，攻毒后各组IFN-γ、TNF-α、IL-4的表达量多于二免后，说明它们可能是与猪H1N1流感病毒感染BALB/c小鼠的相关细胞因子，并且根据这些细胞因子的表达情况，表明重组慢病毒引起小鼠机体产生的是以Th1型为主的细胞免疫反应。以上结果表明，表达HA-GCN4的重组慢病毒在感染293T细胞后HA-GCN4基因能有效地表达，并且GCN4序列能够增强HA基因的三聚体活性；重组慢病毒诱导BALB/c小鼠产生了良好的体液免疫与细胞免疫反应，有效地抵御了猪H1N1流感病毒的感染。因此，本研究为下一步进行本动物实验及今后防控猪流感提供了理论基础和实验数据。