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本研究以杭白芷[Angelicadahurica(Fisch. ex Hoffm.)Benth.etHook.f.var.formosana(Boiss.)ShanetYuan]根为实验材料,利用光学显微镜、透射电子显微镜、组织化学定位、TUNEL与PI检测、类caspase-3蛋白酶免疫组织化学以及细胞自噬特异性抗体Anti-ATG8antibody-CY3和溶酶体Lyso-TrackerGreen(LTG)免疫荧光双标共定位等技术,研究杭白芷根发育过程中香豆素类成分主要积累部位及含量变化,再进一步探明根中分泌道发生方式、分布及其挥发油转运积累特征,同时对分泌道发生过程的超微结构及进行了细致观察,结合植物细胞程序性死亡(PCD)与细胞自噬相关检测信号,为裂生型分泌道发育过程中PCD和细胞自噬参与提供实验证据,旨在揭示杭白芷根中分泌道发生及其发育过程中成分积累特征,为进一步了解分泌道与成分积累关系奠定基础,以期阐明裂生型分泌道发生机制。主要研究结果如下:
1.应用植物解剖学方法对杭白芷主根进行了解剖观察,结合组织化学定位法以及高效液相色谱法对主要药用成分的积累部位及含量进行研究,结果表明杭白芷根分泌道主要分布在皮层和次生韧皮部;组织化学成分定位表明,分泌道是主要药用成分香豆素类的积累部位,在根的生长发育过程中,欧前胡素、异欧前胡素以及总含量大体呈上升趋势,9~10月份出现含量峰值,结合分泌道数量以及根直径大小统计结果,进一步表明分泌道与药材的质量紧密相关。
基于杭白芷根发育过程中香豆素类成分主要积累部位及含量变化研究的特征,利用烃类显色剂可以将分泌道内的香豆素类成分明显的显示出来,建立一种白芷饮片优劣的简易鉴别方法。
2.利用光学显微镜及透射电子显微镜技术详细观察了分泌道发生过程及挥发油转运特征,结合组织化学定位确定挥发油的主要积累部位,结果表明:杭白芷根中分泌道由中柱鞘细胞与韧皮部细胞先后起源发生。挥发油的合成不仅与分泌细胞中质体及细胞质有关,还与周围细胞关系密切。分泌细胞内高尔基体和内质网丰富,可能通过形成小泡参与转运,再经由细胞壁向腔道内转移。相邻分泌细胞靠近角隅处的细胞壁分泌活动活跃,腔道内积累大量电子致密物质。结合组织化学定位结果,成熟分泌道中分泌细胞及其腔道内均积累大量油滴,因此挥发油主要积累场所为分泌细胞及其腔道。
3.利用显微技术及超微技术观察杭白芷根中分泌道发育过程中的形态学特征,将分泌道的发育过程分为四个阶段,分别为:原始细胞期、腔隙形成期、膨大期和成熟期,在此过程中到分泌细胞的细胞核中染色质凝集且边缘化,核膜弥散,质体、线粒体等细胞器降解等。结合TUNEI检测和PI染色及类caspase-3蛋白免疫组织化学定位发现除原始细胞期外的其余时期均有DNA断裂的阳性信号,蛋白酶在原始细胞期信号强,随后逐渐减弱,表明植物PCD参与了杭白芷根中分泌道的发育过程。同时发现分泌道超微结构也具有典型的细胞自噬特征,再运用细胞自噬特异性抗体Anti-ATG8antibody-CY3和溶酶体探针LTG免疫荧光双标共定位的方法,观察了分泌道发育过程中细胞自噬的特异性信号表达,结果表明细胞自噬也参与其中,裂生型分泌道的发生可能是二者共同作用的结果。以上研究旨在为阐明裂生型分泌道的发生机制提供理论依据。
1.应用植物解剖学方法对杭白芷主根进行了解剖观察,结合组织化学定位法以及高效液相色谱法对主要药用成分的积累部位及含量进行研究,结果表明杭白芷根分泌道主要分布在皮层和次生韧皮部;组织化学成分定位表明,分泌道是主要药用成分香豆素类的积累部位,在根的生长发育过程中,欧前胡素、异欧前胡素以及总含量大体呈上升趋势,9~10月份出现含量峰值,结合分泌道数量以及根直径大小统计结果,进一步表明分泌道与药材的质量紧密相关。
基于杭白芷根发育过程中香豆素类成分主要积累部位及含量变化研究的特征,利用烃类显色剂可以将分泌道内的香豆素类成分明显的显示出来,建立一种白芷饮片优劣的简易鉴别方法。
2.利用光学显微镜及透射电子显微镜技术详细观察了分泌道发生过程及挥发油转运特征,结合组织化学定位确定挥发油的主要积累部位,结果表明:杭白芷根中分泌道由中柱鞘细胞与韧皮部细胞先后起源发生。挥发油的合成不仅与分泌细胞中质体及细胞质有关,还与周围细胞关系密切。分泌细胞内高尔基体和内质网丰富,可能通过形成小泡参与转运,再经由细胞壁向腔道内转移。相邻分泌细胞靠近角隅处的细胞壁分泌活动活跃,腔道内积累大量电子致密物质。结合组织化学定位结果,成熟分泌道中分泌细胞及其腔道内均积累大量油滴,因此挥发油主要积累场所为分泌细胞及其腔道。
3.利用显微技术及超微技术观察杭白芷根中分泌道发育过程中的形态学特征,将分泌道的发育过程分为四个阶段,分别为:原始细胞期、腔隙形成期、膨大期和成熟期,在此过程中到分泌细胞的细胞核中染色质凝集且边缘化,核膜弥散,质体、线粒体等细胞器降解等。结合TUNEI检测和PI染色及类caspase-3蛋白免疫组织化学定位发现除原始细胞期外的其余时期均有DNA断裂的阳性信号,蛋白酶在原始细胞期信号强,随后逐渐减弱,表明植物PCD参与了杭白芷根中分泌道的发育过程。同时发现分泌道超微结构也具有典型的细胞自噬特征,再运用细胞自噬特异性抗体Anti-ATG8antibody-CY3和溶酶体探针LTG免疫荧光双标共定位的方法,观察了分泌道发育过程中细胞自噬的特异性信号表达,结果表明细胞自噬也参与其中,裂生型分泌道的发生可能是二者共同作用的结果。以上研究旨在为阐明裂生型分泌道的发生机制提供理论依据。