糖基化是真核细胞蛋白质最常见的转译后修饰方式之一,连接在天冬酰胺上的称为N-糖链,连接在丝氨酸或者苏氨酸上的称为O-糖链。蛋白糖基化在许多生命活动中起重要作用,包括蛋白质折叠、细胞识别、癌细胞增殖、免疫反应等。蛋白N糖基化分析有很多方法。最简单的方法是酶解释放N糖链后直接进行MS质谱分析。Peptide-N-glycosidase F(PNGase F)是一种用来从蛋白或多肽上酶解没有取代的或6位岩藻糖取代的N糖链的酶,现广泛应用于哺乳动物的N糖基化研究中。一些进一步的研究就建立在这些释放下来的N糖链上。更常见的情况下,是将N糖链释放后进行衍生化以改善其分离度和增强检测灵敏度。本研究中建立了一种新的N糖基化的分析方法,其中优化了去糖基化的反应条件和试剂,以加快N糖链的释放速度,并采用了一种能够同时提高分离度和荧光、质谱响应灵敏度的新型标记试剂(RapiFluor-MS)来标记释放下来的糖链。此外,为了简化数据分析难度,我们还建立了一个虚拟的N糖链数据库,使得复杂的N糖链数据能够被自动、精确有效地识别和归属。最终形成一套简单、快速、灵敏、高效的N糖基化分析方法,并将其成功应用到了复杂糖蛋白和癌细胞表面N糖基化分析中。另外,由于目前没有广谱O-糖基解离酶,我们初步建立了一种有效的O-糖链分析方法。该方法采用了高能碰撞解离产物离子相关电子转移解离(HCD-pd-ETD)二级质谱模式对广谱蛋白酶降解得到的糖肽进行分析,并对数据采用较新的Byonic软件进行了分析,这种方法可以同时得到O-糖基化位点和糖链形式两种信息。该方法有效的应用到了复杂糖蛋白人重组骨唾液酸化蛋白(rhiBSP)的O-糖链分析和解析过程中,获得了比传统方法更准确和丰富的糖基化位点和糖链结构信息。