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研究背景:骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是一种常见的运动系统病变。在我国,大约有5.7%的男性、10.3%的女性都患有不同程度的骨关节炎症状。OA好发于膝、髋等负重程度较高的关节,主要临床症状为关节疼痛、僵硬、活动受限和终末期关节畸形等。目前骨关节炎主要采取非甾体药物止痛、减重、功能锻炼等对症处理,终末期必要时行关节置换手术,给患者及家庭、社会均带来严重负担。在关节活动中,软骨和软骨下骨共同承担关节的负重。研究发现,在OA中,软骨下骨的变化比软骨的变化更早。软骨下骨是一个处于动态平衡的组织,受激素信号和物理刺激的影响,软骨下骨也在不断进行重塑。在机械力变化比如关节不稳时,骨耦联的平衡被打破,骨细胞感受机械力的变化,诱导破骨细胞激活,吸收软骨下骨骨基质。骨基质中TGF-β1等被释放,刺激间充质干细胞（MSC）分化,促进异常骨岛形成和异常血管形成。异常骨耦联导致的骨岛和血管形成后,可影响覆盖在软骨下骨上的关节软骨,使关节软骨受损,从而促进关节炎发生。研究发现,抑制OC活性,可以抑制软骨下骨异常骨重建,从而抑制OA进展。在OA过程中,血管生成也明显增多。研究发现,血管生成抑制剂在抑制OA进展中也有重要作用。甜菜碱是一种极易溶于水的生物碱,化学式为C5H11NO2,有轻微特征气味（甜味）,在枸杞、豆科等植物中均含有甜菜碱。有研究表明,甜菜碱可降低组织中NF-κB,MAPK,TGF-β1,基质金属蛋白酶2（MMP-2）,VEGF水平,具有抗炎、抗纤维化、抗半胱氨酸血症等多种药理作用。由于炎症、NF-κB,MAPK与破骨细胞的激活密切相关、MMP-2和VEGF与血管生成密切相关、因此我们推测甜菜碱可能具有潜在的抑制破骨细胞的活性和抑制血管生成的作用。本研究旨在观察甜菜碱对前交叉韧带切断术（ACLT）导致的小鼠骨关节炎的作用,并研究其抑制关节炎进展可能的分子机制。研究目的:1、通过体外实验,研究甜菜碱对OC生成的影响和机制;2、通过给予OA小鼠甜菜碱处理,研究甜菜碱对ACLT导致的OA小鼠关节软骨的保护作用;3、通过给予OA小鼠甜菜碱处理,研究甜菜碱对ACLT导致的OA小鼠软骨下骨异常骨重建的作用;4、通过给予OA小鼠甜菜碱处理,研究甜菜碱对ACLT导致的OA小鼠软骨下骨中异常血管形成的作用。研究方法:第一部分:通过体外实验,研究甜菜碱对于OC生成的影响和机制用成品RAW264.7细胞和小鼠BMMCs两种细胞,分别诱导其向OC分化。细胞分为对照组和甜菜碱处理组。甜菜碱处理组分别加入不同浓度的甜菜碱（0μM,125μM,250μM,500μM）。诱导完成后,行TRAP染色检测OC分化情况。将BMMCs细胞分为对照组和甜菜碱处理组,诱导其向OC分化。甜菜碱处理组分别加入不同浓度的甜菜碱（0μM,500μM）。经诱导后,行DCFH-DA染色检测细胞活性氧产生情况,行Western-blot技术检测下游MAPK通路激活情况。第二部分:通过给予OA小鼠甜菜碱处理,研究甜菜碱对ACLT导致的OA小鼠关节软骨的保护作用将8周龄雄性C57B6/L小鼠随机分为3组:假手术组、ACLT组和ACLT+甜菜碱组。对ACLT组和ACLT+甜菜碱组的小鼠行右膝关节前交叉韧带离断术,构建力学不稳导致的OA模型。假手术组切开右膝关节皮肤和关节囊,不离断前交叉韧带。将甜菜碱按2%W/V浓度溶于小鼠日常饮用水中,术后第二天开始给予甜菜碱处理。分别于第14天、30天、60天收取小鼠膝关节并制作切片。行番红固绿染色检测关节软骨病理损伤情况;行HE染色检测钙化软骨、透明软骨变化情况;免疫荧光染色检测软骨细胞相关marker因子变化情况。第三部分:通过给予OA小鼠甜菜碱处理,研究甜菜碱对ACLT导致的OA小鼠软骨下骨异常骨重建的作用小鼠分组和手术造模同第二部分。将甜菜碱按2%W/V浓度溶于小鼠日常饮用水中,术后第二天开始给予甜菜碱处理。分别于第14天、30天、60天收取小鼠膝关节并制作切片。Micro-CT检测小鼠膝关节软骨下骨组织相关指标变化情况;TRAP染色检测软骨下骨中OC激活情况;第四部分:通过给予OA小鼠甜菜碱处理,研究甜菜碱对ACLT导致的OA小鼠软骨下骨中异常血管生成的作用小鼠分组和手术造模同第二部分。将甜菜碱按2%W/V浓度溶于小鼠日常饮用水中,术后第二天开始给予甜菜碱处理。于第30天收取小鼠膝关节并制作切片。血管造影检测小鼠膝关节软骨下骨中血管形成情况;免疫荧光检测血管形成相关marker因子变化情况。结果:1、甜菜碱可以抑制OC生成。加入RANKL+M-CSF诱导单核巨噬细胞（BMMCs）分化为破骨细胞的过程中,细胞ROS产生水平升高,甜菜碱处理可以抑制ROS的产生,还可以抑制MAPK通路的激活;2、与假手术组小鼠相比,ACLT组小鼠的关节软骨损伤程度明显加重,关节损伤OARSI评分明显升高,透明软骨厚度明显下降,钙化软骨厚度明显升高。软骨保护标记物Lubricin水平明显下降,而软骨损伤标记物如X型胶原（Col X）、基质金属蛋白酶13（MMP-13）水平明显上升。甜菜碱处理可以减轻软骨损伤的程度,保护透明软骨厚度,降低钙化软骨厚度。甜菜碱还可以降低Col X、MMP-13水平,升高Lubricin水平;3、与假手术组小鼠相比,ACLT组小鼠软骨下骨重建异常,表现为骨小梁模式因子（Tb.Pf）上升、软骨下骨板厚度（SBP Th）下降、骨体积分数（BV/TV）下降。TRAP染色显示软骨下骨中OC活性明显升高。甜菜碱可以抑制软骨下骨异常骨重建,并抑制软骨下骨中OC活性;4、与假手术组小鼠相比,ACLT组小鼠软骨下骨中血管生成增多,表现为血管总体积和数量明显升高,CD31和Endomucin阳性血管数量明显增多,MMP-2表达水平明显上升。甜菜碱可以抑制软骨下骨异常血管形成,降低血管数量和总体积,减少CD31和Endomucin阳性血管数量并降低MMP-2表达水平。结论:1、甜菜碱可以抑制OC生成。在机制上,甜菜碱可以抑制RANKL诱导的ROS产生及下游MAPK通路的激活;2、甜菜碱可以减轻OA小鼠的关节炎进展,保护关节软骨;3、甜菜碱可以抑制OA小鼠软骨下骨异常骨重建,抑制破骨细胞活性;4、甜菜碱可以抑制OA小鼠软骨下骨中异常血管形成。