皖江流域地区养殖场数量较多,畜禽养殖过程中产生了大量粪便。畜禽粪便是重要的农业面源污染之一,其中主要的微生物风险是病原菌和耐药菌。畜禽粪便中的病原菌影响畜禽养殖业的发展,直接威胁人类和动物的健康,而耐药菌中的耐药基因可以通过水平基因转移而传播到病原菌中,使得病原菌成为耐药的病原菌也叫致病性耐药菌。致病性耐药菌带来的问题已然是全球性的公共卫生危机。细菌性病原体的致病性取决于它们拥有的毒力因子,而耐药菌的耐药类型取决于它们携带的耐药基因。因此,对畜禽粪便的微生物风险进行监测的两个重要目标就是毒力基因和耐药基因。本研究通过宏基因组学对皖江流域部分地区的7个鸡粪便样本和14个猪粪便样本中毒力基因与耐药基因的类型、丰度及它们之间的相关性进行研究,对畜禽粪便中携带毒力基因和耐药基因的宿主微生物进行鉴定,利用组合的宏基因组分箱算法复原携带耐药基因和毒力基因的细菌基因组。主要研究内容如下:1.畜禽粪便中耐药基因和毒力基因的注释、丰度计算和相关性分析本研究在21个畜禽粪便样本中一共检测到29种耐药类型和526种耐药基因亚型,主导的耐药类型是多药耐药类,氨基糖苷类和四环素类。鸡粪便样本中耐药基因的总丰度分布相对集中（2226～3894 TPM）,而猪粪便样本中耐药基因的总丰度分布波动较大（1930～9282 TPM）。本研究还鉴定了由128个ARG亚型组成的鸡粪便微生物核心抗生素抗性组和51个ARG亚型组成的猪粪便微生物核心抗性组,主成分分析发现它们之间有明显的差异。所有样本中共检测到347种毒力基因亚型,属于12种毒力基因类型,主导的类型是攻击性,运动性和非特异性毒力基因。不同类型毒力基因的相对丰度以及绝对丰度与样本来源无关而是与畜禽粪便微生物群落结构有关,因为毒力基因集中在较少的潜在病原菌上。相关性分析发现,毒力基因和耐药基因在总丰度和亚型数量方面都有极显著的正相关关系;共发生网络分析显示攻击性毒力基因与多耐药类耐药基因有显著联系。2.畜禽粪便中耐药基因与毒力基因的宿主菌的鉴定通过对携带毒力基因的重叠群进行物种注释发现:埃希氏菌属、克雷伯菌属、弯曲杆菌属和假单胞菌属等物种携带毒力基因数量较多,比如在CA组中,埃希氏菌属和克雷伯菌属分别携带了118和72个毒力基因。在猪粪便样本中,携带毒力基因的埃希氏菌属和不动杆菌属的相对丰度占所有潜在病原菌的78.3%和6.5%;在鸡粪便样本中,携带毒力基因的埃希氏菌属,弯曲杆菌属和克雷伯菌属的相对丰度分别是33.8%,31.1%和4.9%。对携带耐药基因的重叠群进行物种注释发现:埃希氏菌属,克雷伯菌属,粪杆菌属,拟杆菌属等物种携带了较多的耐药基因,比如在CA组中,埃希氏菌属和克雷伯菌属分别携带了95和91个耐药基因。在猪粪便样本中,携带耐药基因的埃希氏菌属,不动杆菌属和梭状芽孢杆菌属的相对丰度占所有潜在病原菌的26%,6%和5%;在鸡粪便样本中,携带耐药基因的拟杆菌属,梭状芽孢杆菌属,隐秘杆菌属和埃希氏菌属的相对丰度分别是8%,7%,5%和4%。可见,埃希氏菌属和克雷伯菌属是毒力基因和耐药基因富集的物种,埃希氏菌属还是丰度上的优势物种。本研究利用多重PCR方法对从畜禽粪便中分离的大肠杆菌检测到了15种毒力基因和12种耐药基因。3.畜禽粪便中潜在病原菌及耐药菌基因组的重建与分析为了复原畜禽粪便中微生物的基因组,本研究先对12种分箱方法和3种分箱结果精炼方法从纯净度,完整度,F1分数,调整兰德系数等方面进行了综合性的评估。结果表明groopm2,metabat2和maxbin2具有准确率高、完整性好、消耗计算资源相对较低的特点,DASTool能够有效降低分箱结果的污染度,提高基因组的质量。本研究利用以上4种分箱方法成功复原了719个完整度不小于60%和污染度不大于10%的细菌基因组,其中以硬壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和变形菌门的物种为主。719个细菌基因组中包括16个潜在病原菌基因组,88个潜在耐药菌基因组以及10个潜在致病性耐药菌基因组。致病性耐药菌基因组有5个都是大肠杆菌。复原的大肠杆菌基因组平均携带的毒力基因和耐药基因数量都是48个,不仅包括致病性大肠杆菌O15:H7参考基因组上的所有耐药基因亚型,还额外鉴定到了13个耐药基因亚型,其中7个都属于多药耐药类。综上所述,本研究发现皖江流域地区畜禽粪便微生物携带了数量众多,类型丰富的毒力基因与耐药基因,它们的丰度与粪便微生物群落结构相关。这些毒力基因与耐药基因在埃希氏菌属和克雷伯菌属等物种中富集,它们应当被密切关注和监测;埃希氏菌属、弯曲杆菌属和拟杆菌属等物种是丰度较高的潜在病原菌和耐药菌,应当作为畜禽粪便无害化处理的重点对象。大肠杆菌是畜禽粪便中最重要的毒力基因与耐药基因宿主。本研究结果为皖江流域畜禽粪便微生物风险评估和畜禽粪便的污染控制提供参考,对保障皖江流域地区的公共卫生安全和畜禽养殖产业的可持续发展有重要意义。