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【目的】 1. 明确SIRT1与miR-221/222表达相关性。 2. 探究SIRT1对miR-221/222启动子区活性的影响。 3. 研究miR-221/222对细胞自噬、损伤等细胞表型的影响。 4. 探讨SIRT1与miR-221/222在调节细胞自噬过程中的关系。 【方法】 1. 在HEK293细胞中过表达或沉默SIRT1的表达，利用荧光定量 PCR 检测miR-221和miR-222的表达情况。 2. 通过查找文献得到miR-221/222启动子区序列，双荧光素酶报告系统检测SIRT1对miR-221/222启动子区活性的影响。转录因子预测软件JASPAR 做miR-221/222启动子区转录因子结合位点预测分析，筛选出与miR-221/222相关度较高的的转录因子，通过Western blot 验证转录因子与SIRT1之间是否有相关性。 3. 过表达或抑制miR-221/222，随后用雷帕霉素处理细胞诱导自噬或者新致癌菌素（ NCS ）处理细胞引起细胞损伤。运用Western blot检测自噬相关蛋白（LC3-I/II、p62）和DNA损伤标记蛋白（γ-H2AX），观察miR-221/222对细胞自噬和DNA损伤修复的影响。 4. 在HEK293细胞中过表达SIRT1后再进一步抑制miR-221和miR-222，加用雷帕霉素处理细胞诱导自噬。Western blot检测自噬标志蛋白，探讨SIRT1与miR-221/222在调节细胞自噬进程过程中的关系。 【结果】 1. 过表达SIRT1促进miR-221/222的表达，沉默SIRT1抑制miR-221/222的表达 在HEK293细胞中转染SIRT1的过表达质粒或转染siSIRT1干扰片段， Western blot结果显示SIRT1蛋白成功过表达或被抑制。qPCR结果显示，SIRT1过表达效率达到上千倍，抑制效率25%左右。过表达SIRT1时miR-221/222的表达升高，干扰SIRT1后miR-221/222的表达水平下调。 2. SIRT1促进miR-221/222启动子区域活性 将成功构建的双荧光素酶报告载体pEZX-GA01-P221/222和SIRT1过表达质粒共转染入HEK293细胞，结果显示过表达SIRT1可显著提高miR-221/222基因簇启动子区活性。此外，进一步在细胞中转染siSIRT1和双荧光素酶报告质粒，发现沉默SIRT1的表达，可显著抑制miR-221/222启动子区活性。提示SIRT1可在转录水平调节miR-221/222的表达。 转录因子预测软件JASPAR预测筛选出转录因子AP-1、NF-κB、FOXO3与miR-221/222启动子区相关度较高。Western blot结果显示这些转录因子与SIRT1表达并无明显相关性，介导SIRT1与miR-221/222调控的转录因子有待进一步研究。 3. 过表达miR-221/222可促进HEK293细胞自噬，但对DNA损伤修复无明显影响 在HEK293细胞中转染Agomir-221/Agomir-222或Agomir NC（对照）以及Antagomir-221/Antagomir-222或Antagomir NC（对照），然后用雷帕霉素处理细胞诱导自噬，用NCS处理细胞引起细胞损伤。q-PCR结果过显示过表达效率上百倍，抑制效率30%左右。随后利用Western印迹检测自噬和损伤相关蛋白。结果显示：过表达miR-221/222可以促进HEK293细胞自噬；反之，抑制miR-221/222则延缓细胞自噬。miR-221/222的表达与DNA损伤修复无明显关系。 4. 抑制miR-221/222表达可使SIRT1的自噬诱导作用减弱 利用HEK293细胞转染Antagomir-221/Antagomir-222片段24 h后，再转染SIRT1质粒入细胞，24 h后加用雷帕霉素（2.5μmol/L）处理细胞24h，诱导细胞自噬，Western blot结果显示：相比对照组，抑制miR-221/222的实验组LC3-II蛋白的表达减弱，说明抑制miR-221/222的表达可使SIRT1的自噬诱导作用减弱。 【结论】 1. SIRT1促进miR-221/222的表达。 2. SIRT1促进miR-221/222启动子区域活性。 3. 过表达miR-221/222促进HEK293细胞自噬，对DNA损伤修复无明显影响。 4. 抑制miR-221/222表达可使SIRT1的自噬诱导作用减弱。