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目的本课题以大鼠大脑中动脉栓塞模型(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO)模拟缺血性脑卒中,考察大鼠脑缺血再灌注损伤后自噬的变化及通窍活血汤(Tong-Qiao-Huo-Xue-Decotion,TQHXD)对细胞自噬的调节作用和相关机制研究。方法1.大鼠脑缺血再灌注损伤后自噬的初步研究(1)采用Western Blotting法,考察了自噬标志蛋白在大鼠脑缺血再灌注不同时间点的表达(2)透射电镜观察大鼠脑缺血2 h再灌注24 h自噬的超微结构(3)尼氏染色观察缺血再灌注不同时程大鼠脑组织病理变化(4)免疫荧光双标法定位自噬在大鼠脑缺血再灌注后脑组织不同细胞中的表达2.TQHXD对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用通过检测神经行为学评分和脑梗死体积,研究不同剂量TQHXD对脑缺血再灌注损伤大鼠的神经保护作用3.TQHXD对脑缺血再灌注自噬的影响(1)脑缺血再灌注损伤的大鼠给予TQHXD,脑梗死体积、神经行为学评分评价TQHXD脑保护作用,HE染色观察脑组织病理变化,Western Blotting法和免疫荧光染色检测自噬标志蛋白表达。(2)TQHXD和3-MA合用给予脑缺血再灌注损伤的大鼠,脑梗死体积、神经行为学评分评价药物脑保护作用,HE染色观察脑组织病理变化,Western Blotting法和免疫荧光染色检测自噬标志蛋白表达。(3)TQHXD和Rapa合用给予脑缺血再灌注损伤的大鼠,脑梗死体积、神经行为学评分评价药物脑保护作用,HE染色观察脑组织病理变化,Western Blotting法和免疫荧光染色检测自噬标志蛋白表达。4.TQHXD调控脑缺血再灌注发生自噬的机制研究采用Western Blotting检测PI3K/AKt/m TOR信号通路上相关蛋白及磷酸化蛋白(AKt,p-AKt,m TOR,p-m TOR)的表达情况。结果1.大鼠脑缺血再灌注损伤后自噬的初步研究(1)Western Blotting结果显示大鼠脑缺血再灌注损伤后自噬激活,随着再灌注时间的增加,自噬相关蛋白Beclin1和LC3的表达也逐渐增强,再灌注24 h达到峰值。(2)大鼠脑缺血2 h再灌注24 h后,透射电镜下观察可见双层膜结构的自噬体。(3)尼氏染色说明再灌注24 h时脑损伤也最严重,说明自噬的激活有损伤作用。(4)免疫荧光双染法表明自噬在神经元、星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞中均有表达。2.TQHXD对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用TQHXD对大鼠脑缺血再灌注损伤有较好的保护作用,能够有效地降低神经行为学评分分值和脑梗死体积,当剂量为6 g/kg时,效果最为明显,所以将该剂量作为通窍活血汤的最优剂量。3.TQHXD对脑缺血再灌注自噬的影响(1)与模型组相比,TQHXD能够显著抑制自噬标志性蛋白的表达,改善神经行为学评分分值和脑梗死体积。(2)TQHXD和3-MA合用与模型组相比,能够显著抑制自噬标志性蛋白的表达,改善神经行为学评分和脑梗死体积。(3)TQHXD和Rapa合用与模型组相比,不能显著抑制自噬标志性蛋白的表达,也没有显著改善神经行为学评分和脑梗死体积。4.TQHXD调控脑缺血再灌注发生自噬的机制研究TQHXD可以上调p-AKt和p-m TOR的水平,抑制自噬标志性蛋白的表达,改善神经行为学评分和脑梗死体积。结论实验结果表明,大鼠脑缺血再灌注损伤后自噬被激活,透射电镜下可见双层膜结构的自噬体,随着再灌注时间的增加,自噬相关蛋白Beclin1和LC3的表达也逐渐增强,再灌注24 h时达到峰值,此时通过尼氏染色说明神经损伤也最严重。免疫荧光双染法表明自噬在神经元、星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞中均有表达。TQHXD能够激活PI3K/AKt/m TOR通路,抑制脑缺血损伤后的神经细胞自噬,继而发挥了神经保护的作用。