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细胞蛋白alpha-actinin参与丙型肝炎病毒复制机理的初步研究丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus, HCV)属黄病毒科丙型肝炎病毒属,其基因组为长约9.6kb的单股正链线性RNA,基因编码框架由5’端非编码区(5’Non-coding region,5’NCR)、长读码框架及3’端非编码区(3’ Non-coding region,3’NCR)三部分组成,长读码框架编码一大小约为3100氨基酸残基的多蛋白前体,该蛋白前体经病毒自身及宿主细胞的蛋白酶切割后,产生至少10种蛋白产物,分别为结构蛋白(C、El、E2、p7)和非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NA4B、NS5A和NS5B)。目前认为除HCV非结构蛋白外,还有一些细胞蛋白共同参与HCV基因组复制。本室前期研究结果表明,细胞蛋白alpha-actinin可与HCV RNA多聚酶NS5B相互作用参与调控HCV亚基因组RNA合成,但alpha-actinin对HCV复制的调控机制仍不甚清楚。本课题对alpha-actinin蛋白参与病毒复制的分子机制进一步深入研究。首先在HCV亚基因组复制子系统和HCV体外感染(HCVcc)系统中证实alpha-actinin蛋白为HCV复制所需。利用特异性siRNA抑制HCV亚基因组复制子细胞中内源性alpha-actinin蛋白表达,结果发现细胞内HCV非结构蛋白(NS3和NS5A)和病毒RNA水平下降。HCV感染实验结果亦发现HCV NS5A表达被显著抑制,细胞里内RNA水平和上清的RNA含量明显下降,分别降至对照组的20%和10%。文献报导alpha-actinin蛋白受磷酸化调节,为探索alpha-actinin蛋白磷酸化是否与HCV复制相关,本课题对HCV亚基因组复制子细胞和Huh7细胞中alpha-actinin蛋白磷酸化水平进行了比较,结果发现与Huh7细胞相比,alpha-actinin蛋白在HCV亚基因组复制子细胞中的磷酸化程度较低,提示alpha-actinin低磷酸化可能与HCV复制有关。进一步在HCV亚基因组复制子细胞中分别瞬时转染alpha-actinin蛋白磷酸化失活体(Y12F)和全长alpha-actinin(FL),结果显示磷酸化失活体(Y12F)的表达能够促使细胞内HCV非结构蛋白NS3和NS5A表达上调,HCV RNA水平上升。HCV感染实验结果显示与对照组相比,过表达alpha-actinin蛋白磷酸化失活体(Y12F)和全长alpha-actinin(FL)细胞内HCV NS5A和病毒RNA及上清中病毒RNA水平显著增加.上述结果表明alpha-actinin蛋白参与调控HCV复制并可能与低磷酸化水平紧密相关。已知HCV可通过其非结构蛋白与宿主蛋白hVAP33相互作用,在类似脂筏的结构上组装复制复合体。鉴于alpha-actinin参与HCV复制,理论推测它可定位于脂筏结构。因此对alpha-actinin蛋白的细胞内定位做了进一步的研究。将全长alpha-actinin、磷酸化失活体(Y12F)和截短体分别瞬时转染HCV亚基因组复制子细胞,用不连续蔗糖梯度分离复制子细胞中的脂筏成分并进行分析。结果显示全长alpha-actinin及其磷酸化失活体(Y12F)可与HCV非结构蛋白NS5A共定位于脂筏结构,而alpha-actinin截短体不与NS5A共定位脂筏结构。进一步利用免疫荧光检测alpha-actinin蛋白截短体细胞内分布,结果发现alpha-actinin蛋白截短体主要定位胞核。alpha-actinin蛋白的基本生理功能是结合和交联F-肌动蛋白(actin),而文献报道HCV蛋白和复制复合体通过actin蛋白在细胞内运输,据此推测alpha-actinin蛋白参与HCV复制可能需要actin蛋白。为证实这一推测,进一步将缺失与actin结合功能域的alpha-actinin蛋白截短体在HCV亚基因组复制子细胞中过量表达,检测HCV蛋白和RNA水平是否发生变化,结果未发现受影响。以上研究结果表明,alpha-actinin可定位于脂筏结构,进一步提示alpha-actinin蛋白可能是HCV复制复合体成分之一,而是否需要actin蛋白参与则有待进一步利用HCVcc系统深入研究。综上所述,在本室前期发现alpha-actinin蛋白与HCVRNA多聚酶(NS5B)相互作用并促进HCV亚基因组复制的基础上,本研究进一步在亚基因组复制子细胞和HCVcc系统中证实alpha-actinin蛋白为HCV复制所需,并可能与其低磷酸化水平有关,是否需要actin蛋白的参与则有待进一步研究。以上发现为进一步深入阐明HCV复制机理和病毒生活周期打下了良好基础。