水稻碳氮代谢相关基因OsCNM1的图位克隆和功能研究

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水稻是我国主要的粮食作物之一,其产量和品质越来越受到人们的关注。本研究从中嘉早17(YK17)经EMS诱变得到的突变体库中筛选到1个稳定遗传的碳氮代谢缺陷突变体cnm1。对该突变体深入研究发现,突变体cnm1的碳氮代谢存在缺陷,不仅导致产量降低,还会影响稻米品质。主要研究结果如下:1、突变体cnm1的株高、分蘖数、穗粒数和单株产量极显著降低;根系发育不良;灌浆速率极显著降低;成熟期有明显的贪青现象,剑叶的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量极显著升高。成熟种子的粒型发生改变,粒长、粒宽和千粒重极显著降低,并伴有垩白现象。胚乳中总淀粉、直链淀粉和总蛋白的含量降低,可溶性糖的含量升高。胚乳淀粉糊化温度极显著升高,黏度和糊化特性有明显变化。复合淀粉颗粒在发育过程中出现异常,呈开裂状态,且颗粒排列较为松散,颗粒间有较大的空隙。2、不同氮水平条件下,突变体cnm1水培幼苗的株高、干重和根冠比均低于相同处理的野生型,氮含量均高于相同处理的野生型。不同氮水平条件下,突变体cnm1盆栽植株的分蘖数、结实率、每穗粒数、单株产量、各组织的干重、总干重和氮积累量大多低于相同条件下的野生型,各组织的氮含量大多高于相同条件下的野生型。3、利用突变体cnm1与Nip杂交得到的F2群体进行图位克隆,最终将目的基因定位于第10号染色体长臂上约62.3 kb的区间内。该区间共有9个ORF,测序分析后发现只有ORF4(LOC_Os10g25130)的第7个外显子出现单碱基替换(G-A),导致第135位的甘氨酸(Gly135)突变为精氨酸(Arg135)。通过CRISPR/Cas9敲除实验验证,确认OsCNM1(ORF4)就是目的基因。检索OsCNM1后发现,该基因与以克隆的丙氨酸转氨酶基因OsAlaAT1等位。4、OsCNM1为组成性表达,在6 DAF的胚乳中表达量最高,其编码的OsCNM1蛋白含有483个氨基酸残基,定位在细胞质中。OsCNM1氨基酸序列的83-470位有一个转氨基结构域,同源蛋白为丙氨酸氨基转移酶。进化树分析显示OsCNM1蛋白与玉米、小麦、黍、粟等禾本科植物中的丙氨酸转氨酶的相似性较高,与石斛、菠萝、莴苣等非禾本科植物中的丙氨酸转氨酶的相似性较低。5、OsCNM1的一个高度保守的氨基酸位点发生改变,导致丙氨酸转氨酶的酶活极显著降低,并因此而影响了氨基酸的合成,使突变体cnm1成熟种子中的氨基酸含量下降。6、在突变体cnm1中,许多碳代谢相关基因表达紊乱,绝大多数碳代谢相关基因的表达量降低,使丙酮酸不能充分用于碳水化合物的合成而积累在叶片和胚乳中。7、在突变体cnm1中,丙氨酸转氨酶的酶活极显著降低,催化α-酮戊二酸和丙氨酸转化成丙酮酸和谷氨酸的能力减弱,使α-酮戊二酸在组织中积累。当α-酮戊二酸积累时,极显著提高了谷氨酸合成酶(GOGAT)的酶活,使植株有能力吸收同化更多得氮素,也因此提高了氮代谢相关基因的表达水平。
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