[目 的]1.筛选并获得自然卵巢衰老C57小鼠模型,为治疗研究提供实验对象。2.制备C57小鼠脐带间充质干细胞(mUCMSC),为治疗研究提供材料。3.利用衰老C57小鼠模型评价mUCMSC治疗的疗效及机制,探索mUCMSC促进小鼠颗粒细胞(mGCs)抗氧化修复的机制。[方法]1.C57小鼠卵巢衰老模型筛选与评价:维通利华公司购买8天龄和8月龄雌性C57小鼠各50只,体重分别为(15±2.5)g和(20±5)g,常规饲料喂养分别养至2月和18月,各取3只进行阴道涂片观察30天,另各取3只眼球采血检测血清E2、FSH、AMH和INH-B,脱颈椎处死,卵巢组织石蜡包埋切片,HE染色观察卵巢结构并进行窦卵泡计数。2.mUCMSC的制备及鉴定:取妊娠18天的C57孕鼠8只,体外无菌条件下采集小鼠脐带,用组织块贴壁培养,胰酶消化法纯化mUCMSC,显微镜下观察形态,流式细胞术分析CD29、CD34和CD90阳性细胞比例,定向诱导mUCMSC分化为骨、脂肪和软骨细胞,分析其分化潜能。3.mUCMSC治疗:将18月龄C57小鼠随机分为模型对照组和治疗组,同时将2月龄C57小鼠设置为青年对照组,各15只,治疗组尾静脉注射GFP标记的mUCMSC,1X107个/kg,体积100ul,每周一和周四注射,连续3周,模型对照组和青年对照组注射同等体积生理盐水,mUCMSC末次注射1月后取材进行疗效评价和机制研究。4.mUCMSC移植疗效评价:观察小鼠毛色并计算小鼠卵巢指数;ELISA检测血清E2、FSH、AMH及INH-B水平;大体解剖观察卵巢形态、大小,HE染色观察卵巢组织结构并进行窦卵泡计数。5.mUCMSC作用机制研究:(1)免疫组化分析卵巢组织衰老相关蛋白(P53、P16、SOD1)、自噬相关蛋白(becline1、LC3b、sirt1、sirt3、p62)、凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、Caspase-3)以及颗粒细胞特异蛋白FSHR的表达水平;(2)Tunnel染色观察卵巢组织凋亡情况;(3)qRT-PCR检测衰老相关基因(P53、SOD2)、自噬相关基因(becline1、LC3b、sirt1)、凋亡相关基因(Bax、Bcl-2、Caspase-3)以及过氧化酶基因(PRDX I、PRDX IV、PRDX V、PRDX VI)的转录水平;(4)小鼠卵巢颗粒细胞转录组测序:采用Smart-seq2技术,对C57小鼠卵巢颗粒细胞的mRNA进行测序,利用生物信息学方法对测序数据进行统计分析,找出差异蛋白编码基因和通路;(5)C57小鼠原代mGCs,培养至P1代,用浓度为1mmol/L的H202诱导4h,建立mGCs的氧化应激模型,与mUCMSC用transwell板间接共培养,下面为mGCs,上面为mUCMSC,流式检测细胞的凋亡和ROS水平,qRT-PCR检测凋亡相关基因Bax和抑凋亡基因Bcl-2的转录水平。[结 果]1.衰老C57小鼠(18月龄)与青年C57小鼠(2月龄)相比动情周期紊乱,血清INH-B水平降低(p<0.05),卵巢体积变小,卵巢实质被间质细胞占据,各级卵泡消失。2.mUCMSC:组织块贴壁法培养mUCMSC第二天即有细胞爬出,6天细胞融合率达80%,传代至P3代mUCMSC细胞呈短梭形,P4代mUCMSC表达间充质干细胞标志物阳性标记物CD90、CD29的阳性率为100%、98.6%,表达间充质干细胞阴性标记物CD34的阳性率为0.39%,P4代mUCMSC成脂诱导分化后饱和油红0染色为阳性,成骨诱导分化后茜素红染色阳性,成软骨诱导后阿尔新蓝染色阳性。3.mUCMSC移植疗效:与模型对照组相比,治疗组小鼠毛色变得黑亮,白色毛发消失;小鼠卵巢指数较模型对照组升高;小鼠血清E2、AMH、INH-B水平较模型对照组明显增加([<0.05);治疗组小鼠卵巢大体观察体积变大,组织学观察显示卵巢结构清晰,皮质区可见到各级卵泡,窦卵泡计数升高。4.mUCMSC机制研究结果:(1)免疫组化结果显示,与模型对照组相比,治疗组衰老相关基因(P16、SOD1)、自噬相关基因(becline1、LC3b)、凋亡基因Caspase-3和颗粒细胞特异表达基因FSHR表达的蛋白水平降低(p<0.05),自噬相关基因sirt3表达的蛋白水平升高(p<0.05);(2)Tunnel染色结果显示治疗组凋亡率较模型对照组明显降低(p<0.05);(3)qRT-PCR结果显示与模型对照组比较,治疗组凋亡相关基因(Bax、Caspase-3)和自噬相关基因(LC3b)的转录水平降低(p<0.05),衰老相关基因(SOD2)和过氧化酶基因(PRDX Ⅰ、PRDX IV)的转录水平升高(p<0.05);(4)测序结果:模型对照组与青年对照组比较,参与炎症反应、免疫反应的基因表达上调,参与PI3K-Akt信号通路、P53信号通路、调节细胞群增殖、IGFBPs对IGF转运和摄取调节的基因表达下调,治疗后,除参与炎症反应的基因下调,其余治疗后均上调;(5)mGCs氧化应激模型,与对照组相比,模型组细胞凋亡增加、细胞ROS水平升高、凋亡基因Bax的转录水平升高、抑凋亡基因Bcl-2的转录水平降低(p<0.05);与mUCMSC共培养后,细胞凋亡减少、细胞ROS水平降低、凋亡基因Bax的转录水平降低、抑凋亡基因Bcl-2的转录水平升高(p<0.05)。[结 论]1.常规饲养至18个月的C57小鼠卵巢体积变小,INH-B水平降低,各级卵泡消失,可以作为研究卵巢衰老的模型。2.通过组织块贴壁法获得纯度高、增值活力强、具有多向分化潜能的mUCMSC。3.mUCMSC移植治疗卵巢衰老小鼠后,小鼠卵巢体积增大,皮质区可见各级卵泡,窦卵泡计数升高,血清E2、AMH、INH-B水平升高,表明卵巢储备功能明显改善,mUCMSC对卵巢衰老产生疗效。4.mUCMSC通过下调凋亡相关基因(Bax、Caspase-3)的表达,并上调SOD2、过氧化物酶基因PRDX IV的表达,同时降低颗粒细胞的凋亡率和ROS水平,还通过调节免疫、抗炎并上调PI3K-Akt和P53信号通路、上调细胞群增殖、IGFBPs对IGF转运和摄取调节的基因表达从而发挥作用促进衰老卵巢的修复。5.成功建立了 mGCs氧化应激模型,mUCMSC共培养可提高mGCs抗氧化应激能力减少mGCs的凋亡。