研究背景及目的:禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是禽类重要的病原,可引起零星和非持续的感染人事件,在其所有的型别中,高致病性AIV(H5和H7)对禽类养殖业和人类健康均可产生严重的威胁。我国禽流感病毒的生态比较复杂,不同地区和不同生态环境中AIV流行特征不尽相同,而南方地区则一直被称为AIV的“生发中心(Epicenter)”,中国大部分AIV感染病例也都发生于此。值得关注的是,活禽市场作为各种禽类的汇集地,其AIV的阳性率高,型别复杂,且是人感染AIV重要的直接源头。野生鸟类作为AIV的天然宿主,在AIV的长距离传播中起到重要作用,且通过基因重排为新亚型病毒的形成提供基础。而散养家禽因有机会与野生鸟类接触,使得AIV可从野生鸟类传入家养禽类,从而也是病原传播的重点关注对象,但关于其如何影响我国AIV的多样性和遗传进化并不明确。近年来新亚型禽流感病毒在我国不断出现和流行,并发生感染人的事件,造成严重的后果,对此本研究选取位于我国中南部的湖北省、浙江省和江西省一些地区的活禽市场作为AIV的监测点,在特定时间内实时监测AIV的流行特征,系统地研究AIV的基因多样性及遗传变异情况。同时为了研究不同来源AIV的流性特征,以及AIV在不同的生态系统的传播循环,我们同期调查了湖北省武汉市沉湖湿地地区野生鸟类以及周围散养家禽AIV的流行情况。研究方法:(1)本研究于2014-2016年期间选取湖北省武汉市,浙江省温州市、台州市和龙泉市以及江西省赣州市的活禽市场作为AIV监测点,同时选择武汉市沉湖湿地作为野生鸟类和散养禽类AIV的监测点,监测期间每月固定采集主要禽类和野生鸟类的肛拭子和新鲜粪便标本。(2)通过设计流感病毒RT-PCR筛查体系,以及流感病毒各型别的鉴定引物,确定不同地方和不同来源禽流感病毒的流行率和流行型别等特征。(3)对于单一 AIV感染的样本,采用鸡胚分离病毒,通过RT-PCR的方法获得AIV病毒的全基因组编码区序列信息,分析其序列的分子特征,同时构建系统发生树,分析不同地理位置及不同来源AIV的遗传进化关系。结果:(1)2014-2016年间中南部三省多个活禽市场中AIV的流行病学调查本研究于2014-2016年间,在三省的11个城镇中的活禽市场采集主要禽类的肛拭子和新鲜粪便标本共计2021份,RT-PCR检测发现875份为禽流感病毒阳性,阳性率为43.3%,其中混合感染率为35.9%。确定每个阳性样本的感染型别,共发现 15 种亚型 AIV 病毒(H1N2/N4、H2N8、H3N2/N6、H4N6、H5N1/N2/N6、H6N2/N6、H7N3/N9、H9N2、H11N2)。(2)不同地理位置活禽市场AIV的流行特征及型别转换在2014-2015年期间,浙江省活禽市场中流行AIV的主要型别为H9N2、H7N9和H5N1,而湖北省则为H5N6和H9N2。而在2015-2016年期间浙江省主要流行型别为H1N2和H2N8,湖北省为H3N6和H5N6,江西省H6N6和H9N2,因此不同地理位置活禽市场中AIV的主要流行型别有很大的差别。同时,我们发现活禽市场中流行AIV的多样性可以在相对短的时间内发生快速转变,从2014-2015年间到2015-2016年间,湖北省和浙江省活禽市场AIV的主要流行型别分别由H5N6转变为H3N6,以及H9N2转换为H1N2,而且在此基础上还出现了 H2N8、H3N6和H11N2等新的AIV亚型。(3)活禽市场AIV全基因组的基因特征和遗传进化分析为全面分析活禽市场AIV的基因特征和遗传进化关系,我们获得了 13种亚型共计78株禽流感病毒的全基因组编码区序列。根据它们的系统发生分析表明活禽市场中不同型别的AIV之间可发生频繁地基因重排,包括低致病性AIV和高致病性AIV之间以及家禽和野生鸟类之间的重排。其中在三个地区广泛流行着高致病性H5亚型禽流感病毒,本研究发现了 H5N1、H5N2和H5N6三种病毒的多种新型重排基因型。特别是新亚型H5N6病毒在三个地方流行着多达8种以上的基因型,且在较短的时间内不断发生新的基因重排和二次重排事件,在两次AIV的监测时间内,H5N6病毒在湖北和浙江所流行的基因型均发生明显的变异。值得注意的是其中一种新型重排H5N6病毒的内部基因全部来自于H9N2/H7N9,该病毒在国内其他地区已发生多起感染人的病例,而这种新型重排病毒在这三个地区都有流行,分子基因特征提示该重排病毒具有较高的人群感染风险。大多数低致病性AIV表现出复杂的起源进化关系,这表明它们的进化过程也经历过多次重排事件。(4)沉湖湿地野生鸟类和散养禽类AIV的流行特征2014-2016年同期,我们在武汉市沉湖地区分别采集野生鸟类和散养家禽的新鲜粪便各928份和625份,AIV的检测阳性率分别为4.85%和16.8%。野生鸟类流行的AIV型别为H1N1、H4N6、H6N2、H9N2和H11N9,其中主要流行型别为H1N1和H11N9。而在散养家禽流行的AIV为H5N2、H4N6、H6N2和H9N2,其中H4N6和H6N2病毒在武汉地区的不同种的禽类间广泛流行,包括野生鸟类,家养水禽和家养陆生禽类。(5)不同来源AIV全基因组的遗传进化分析和基因交流根据在沉湖湿地地区获得的27株AIV全基因组编码区的系统发生分析,表明沉湖湿地地区AIV具有较大的基因多样性和复杂的进化起源过程,这些病毒可能经历了多次的基因重排事件。同时基于不同来源AIV全基因组编码区的系统发生分析,我们发现活禽市场、野生鸟类和散养禽类这三种不同来源AIV之间有些具有较高的亲缘关系,特别是其内部基因在系统发生树聚集在同一个分支上,说明不同来源的AIV之间可以发生频繁地基因交流。结论:我们的研究表明在我国中南部地区的活禽市场中AIV具有流行率高和基因多样性复杂的特征,不同地理位置AIV流行的主要型别不同,并且在同一地区短时间内可发生AIV主要流行型别的转换。系统发生分析表明活禽市场中AIV正发生着频繁地基因重排现象,三个地区至少流行着八种基因型的新型H5N6重排病毒,其中内部基因来源于H9N2/H7N9的新型H5N6重排病毒广泛流行且具有较高的人群感染风险。同一地区活禽市场、野生鸟类和散养禽类不同来源的AIV之间可以发生频繁地基因交流。