论文部分内容阅读
目的：探讨筛选肿瘤干细胞的方法，在mRNA及蛋白质水平检测RecQ家族解旋酶在乳腺癌及其肿瘤干细胞中的表达水平，并探讨其意义。 方法：（1）采用无血清悬浮培养方法，对乳腺癌细胞 MDA-MB-435进行无血清筛选培养。(2)Hoechst33342染料染色后流式细胞仪侧群分析鉴定乳腺癌干细胞。（3）软琼脂糖凝胶肿瘤克隆形成试验检测乳腺癌干细胞成瘤性。（4）分别提取MDA-MB-435及其肿瘤干细胞、正常人肝细胞L-02、人脐带血干细胞、正常人淋巴细胞的Total RNA，逆转录为cDNA，实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，real—time PCR)检测RecQ家族解旋酶(RecQL、BLM、WRN、RecQ4、RecQ5)的mRNA量，在转录水平探讨乳腺癌细胞及其干细胞的RecQ家族解旋酶 mRNA差异。(5)WesternBlot检测MDA-MB-435及其肿瘤干细胞、L-02、人肝癌细胞HepG2、正常人白细胞中BLM及RecQ4的表达情况，在翻译水平探讨乳腺癌细胞及其肿瘤干细胞RecQ家族解旋酶差异。 结果：（1）采用无血清悬浮培养方法筛选和培养MDA-MB-435肿瘤干细胞成功。（2）Hoechst33342染料染色后流式细胞仪侧群分析鉴定肿瘤干细胞占整个细胞比例90％以上。（3）软琼脂糖凝胶肿瘤克隆形成试验检测肿瘤干细胞成瘤性验证肿瘤干细胞克隆性生长和成瘤潜能比 MDA-MB-435细胞明显增强，有统计学意义（P<0.001）。（4)实时荧光定量 PCR(real-time quantitative PCR，real-time PCR)检测RecQ家族解旋酶成员RecQL、BLM、WRN、RecQ4、RecQ5的mRNA在不同细胞中表达水平发现:与 MDA-MB-435相比，RecQL,BLM,WRN在肿瘤干细胞表达较 MDA-MB-435明显下降（P<0.05），相反，RecQ4，RecQ5在肿瘤干细胞表达较 MDA-MB-435明显升高（P<0.05）。（5） WesternBlot检测MDA-MB-435细胞及其肿瘤干细胞、L-02、HepG2、正常人白细胞中 BLM解旋酶的表达，表达量从低到高依次为正常人白细胞、肿瘤干细胞、MDA-MB-435细胞、L-02、HY-2；RecQ4解旋酶的表达，表达量从低到高依次为正常人白细胞、MDA-MB-435细胞、肿瘤干细胞、L-02、HY-2。BLM在肿瘤干细胞表达较MDA-MB-435下降，RecQ4在肿瘤干细胞表达较MDA-MB-435升高。 结论：RecQL、BLM、WRN在乳腺癌干细胞中表达量下降、RecQ4、RecQ5在乳腺癌干细胞中表达增加，RecQ4、RecQ4/BLM、RecQ5有望成为乳腺癌干细胞一个新的、特异性的标志物，RecQ4，RecQ5有望成为针对乳腺癌干细胞进行治疗的一个新的靶点。