绒癌是一种高度恶性肿瘤，早期即可发生血行转移，导致全身播散。自二十世纪60年代以来，随着HCG监测技术的发展和化学药物的应用，绒癌的临床化疗效果较好。但是化学药物除了能杀伤肿瘤细胞，对正常细胞也有很强的毒副作用，因此限制了化学药物的应用。此外，部分绒癌病人可发生耐药，一旦发生耐药往往是多药耐药，对各种化学药物均不敏感，病人预后极差，转移是其主要死亡原因。 Genistein又名4，5，7—三羟基异黄酮，是大豆异黄酮的一种。流行病学研究表明，Genistein能降低乳腺癌、前列腺癌、肠癌等肿瘤的发生率。许多体内和体外实验研究表明，Genistein能抑制拓扑异构酶Ⅱ的活性、抑制肿瘤细胞的增殖、诱导分化、抑制肿瘤血管新生和蛋白酪氨酸激酶的活性，而对造血细胞、小肠上皮细胞等正常组织细胞无明显的毒副作用。近年来体外实验研究发现，Genistein能抑制乳腺癌、纤维肉瘤和黑色素瘤细胞的侵袭，但其机制尚不清楚。本文旨在研究Genistein对绒癌细胞生物学行为的影响及对绒癌耐药细胞株侵袭能力的影响，探讨影响绒癌耐药细胞侵袭的相关机制，以期寻求一种安全低毒的化疗辅助药物。 本课题共分三部分：1、Genistein对绒癌细胞株JAR生物学行为的影响；2、Genistein对绒癌耐药细胞株JAR／MTX增殖、凋亡和侵袭的影响及作用机制；3、ER-β在Genistein抑制绒癌耐药细胞株JAR／MTX侵袭中的作用。 第一部分 Genistein对绒癌细胞株JAR生物学行为的影响 目的 了解Genistein对绒癌细胞形态学、增殖、分化、细胞周期、凋亡和侵袭的影响。方法 在绒癌细胞JAR的培养基中加入不同浓度的Genistein，每隔24h吸培养上清，测HCG的含量。采用MTT比色法检测不同浓度Genistein对JAR细胞增殖的影响。采用HE染色、电镜、流式细胞术和transwell法检测JAR细胞经Genistein处理72h，细胞形态学和超微结构的变化及Genistein对细胞周期和运动、侵袭能力的影响。体内实验，JAR细胞经Genistein处理48h，于裸鼠背部接种皮下移植瘤，观察成瘤率的变化。结果 Genistein能抑制绒癌细胞JAR的增殖，且具有时间、剂量依赖关系。100nmol／ml Genistein使JAR细胞HCG分泌量增加，并呈时间依赖性。与对照组比较，10、25、50和100nmol／ml处理组细胞侵袭能力分别下降-14.1％(P＞0.05)、75.6％(P＜0.05)、100％(P＜0.05)和100％(P＜0.05)。与对照组(17.44±6.16)比较，100nmol／mlGenistein使细胞周期阻滞在G2-M期(67.14±1.02)。10和100nmol／ml组细胞运动能力分别下降42.3％(P=0.013)和41.3％(P=0.014)。体内实验结果：对照组100％成瘤，实验组成瘤率16.7％。对照组瘤重1.10±0.95g，实验组瘤重0.008±0.020g(P＜0.05) 结论 Genistein能抑制绒癌细胞增殖，促进HCG分泌，导致细胞周期阻滞并抑制绒癌细胞的运动和侵袭能力。 第二部分 Genistein对绒癌耐药细胞株JAR／MTX增殖、凋亡和侵袭的影响及作用机制 目的 了解Genistein对绒癌耐药细胞株JAR／MTX增殖、凋亡和侵袭能力的影响，并探讨侵袭的相关机制。方法 分别采用MTT法、Annxin-V和PI双染法、transwell小室法，检测不同浓度Genistein作用于JAR／MTX细胞72h后细胞增殖、凋亡和侵袭能力的变化。采用RT-PCR技术检测雌激素受体(ER)以及与侵袭有关的MTA3、Snail基因mRNA的表达，并应用蛋白印迹法和明胶酶谱法检测E-钙黏附蛋白(E-cd)和基质金属蛋白酶2(MMP-2)和9(MMP-9)蛋白的表达。 结果 Genistein能抑制JAR／MTX细胞的增殖和侵袭能力，并呈剂量依赖关系。小剂量Genistein(10nmol／ml)仅能引起JAR／MTX细胞发生轻微的凋亡(16.85％)，而25、50、100nmol／mL Genistein则引起大量细胞发生凋亡(54.84％，54.67％，47.50％)和坏死(28.59％，21.60％，44.12％)。与对照组比较，JAR／MTX细胞经Genistein作用后，ERB和MTA3的mRNA表达量增加，Snail基因mRNA表达量减少。E-cd的蛋白表达增加，MMP-2和MMP-9的蛋白表达量减少。 结论 Genistein能抑制JAR／MTX细胞的增殖，诱导细胞发生凋亡和坏死，通过上调E-cd和下调MMP-2以及MMP-9的表达抑制JAR／MTX细胞的侵袭能力，MTA3→Snail→E-cd通路可能是Genistein抑制JAR／MTX细胞侵袭的信号通路之一。第三部分 ER-β在Genistein抑制绒癌耐药细胞株JAR／MTX侵袭中的作用 目的 了解ER-β在Genistein抑制绒癌耐药细胞株JAR／MTX细胞侵袭中的作用。方法 分别采用transwell小室法、western blot法、明胶酶谱法，检测JAR／MTX细胞的ER-β经RNA干扰后，不同浓度Genistein作用于JAR／MTX细胞72h后细胞侵袭能力的变化，以及E-cd和MMP-2、MMP-9蛋白表达的变化。采用RT-PCR法检测JAR／MTX细胞的ER-β经RNA干扰后，50nmol／mlGenistein作用于JAR／MTX细胞0、1h、2h、4h、6h、8h后MTA3和Snail基因mRNA的表达变化。结果 ER-β经RNA干扰后，10和25nmol／mlGenistein抑制JAR／MTX细胞侵袭(62％和72％)的作用被完全抑制(-19.9％和6.3％)，50和100nmol／mlGenistein抑制JAR／MTX细胞侵袭(94％和96％)的作用也被部分抑制(68.7％和81.7％)。与对照组(1)比较，10、25、50和100nmol／ml Genistein上调E-cd表达(2.76、3.03、3.15和2.78倍)的作用均被抑制(0.94、0.97、1.09和1.05倍)，Genistein下调MMP-2和MMP-9的作用也受到抑制。与0点比较，Genistein上调MTA3和下调Snail表达的作用均受到抑制。结论 Genistein通过与ER-β结合，激活ER-β的下游信号途径抑制JAR／MTX细胞的侵袭。