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目的：1.建立补肾通络方稠浸膏前处理方法和同时测定其中马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷含量的分析方法。2.建立同时测定灌胃补肾通络方稠浸膏大鼠血浆中马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷含量的方法,并探究目标成分在大鼠体内的药代动力学行为特征,探讨补肾通络方的药效物质基础。3.通过体外血浆药理学研究,探讨补肾通络方干预肾间质纤维化的作用机制。方法：1.以阿魏酸、二苯乙烯苷、马钱苷为检测指标,用L9(34)正交设计表,选择乙醇用量、乙醇浓度及醇沉时间3个因素,采用方差分析优选出制备补肾通络方稠浸膏的方法；同时检测以上三种成分的HPLC条件为：色谱柱为Hypersil C18(250mm×4.6mm,5μm),流动相为甲醇-0.01%冰醋酸水溶液(35：65),检测波长为240nm(马钱苷)、320nm(阿魏酸和二苯乙烯苷),柱温为30℃,流速为1.0mL/min,进样量为10μL。2.取SD雄性大鼠,自制采血固定器,进行大鼠药代动力学断尾采血,并分别于给药前及灌胃给药后5min、10min、20min、30min、45min、60min、90min、2h、3h、6h、10h、14h、18h、23h各时间点断尾采血0.5mL左右,离心取血浆。采用液-液萃取法处理血浆样品,同时检测血浆中马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷的HPLC条件为：色谱柱为Johnson spherigel C18(250mm×4.6mm,5μm),流动相为甲醇-0.01%冰醋酸水溶液,梯度洗脱,流速为1mL/min,柱温为30℃,检测波长为235nm(马钱苷)、320nm(阿魏酸和二苯乙烯苷),进样量为10μL；用DAS2.0软件进行药动参数计算。3.取SD雄性大鼠,按高、中、低3个剂量灌胃补肾通络方稠浸膏14天,末次灌胃给药后1h左右腹主动脉采血,离心取血浆备用。以肾小球系膜细胞(Glomerular mesangial cells,GMCs)为试验对象,白介素为炎症干预因子,福辛普利为阳性药物,设空白血浆对照组、白介素组、福辛普利组、补肾通络方稠浸膏高、中、低剂量组,共6组。MTT法检测细胞活力；RT-PCR检测TGF-β1和CTGF基因mRNA表达量；ELISA法检测TIEG1、TGF-β1和CTGF蛋白含量。结果：1.补肾通络方稠浸膏最佳前处理方法为：6倍量70%乙醇静置24h提取浓缩；含量测定的方法学考察表明：马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷的质量浓度分别在5～250、0.5～25、6～300μg/mL范围内与各自峰面积呈良好线性关系(r分别为0.9999,0.9999,0.9998)；检测限依次为0.5、0.08和0.2μgmL,定量限依次为5、0.5和6μg/mL；精密度试验RSD小于2%,稳定性、重复性试验RSD均小于3%；平均加样回收率分别为98.3％(RSD=1.9%,n=6).96.3％(RSD=1.9%, n=6)和100.8%(RSD=1.9%,n=6);补肾通络方稠浸膏中马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷的质量浓度分别为2.52,0.292,3.12mg/mL。2.自制断尾采血固定器制作较简单,且操作方便,一天可对20只大鼠重复采血6次,出血量0.5-1.0mL,无大鼠死亡及操作人员受伤情况；血药浓度的方法学考察表明：血浆中内源性物质不干扰样品的测定,马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷质量浓度分别在0.03～3.00、0.03-3.00和0.02～2.00μg/mL范围内与各自峰面积呈良好线性关系(r分别为0.9962,0.9956,0.9963)；检测限依次为0.020、0.015和0.010μg/mL,定量限依次为0.030、0.030和0.020μg/mL；提取回收率分别大于82%、76%和60%；日间、日内精密度(RSD)均分别小于10%、7.8%和9.4%；大鼠血浆中马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷的主要药代动力学参数为：Cmax分别为0.369+0.042、0.387+0.071和0.233±0.044μg/mL,tmax分别为0.226±0.022、0.282±0.031和0.233±0.044h,t1/2(β)分别为6.89+0.20、10.7+0.11和6.93±0.09h,AUC0.∞分别为1.91±0.36、3.22±0.52和1.52±0.33μg·h/mL, AUC0-t分别为1.62±0.33、2.58±0.43和1.30±0.30μg·h/mL,CL分别为20.2±4.0、1.39±0.23和31.7±6.9L/h/kg。3.与空白对照组比较,白介素能诱导GMCs的增殖、上调TGF-β1和CTGF基因mRNA表达、促TIEG1、TGF-β1和CTGF蛋白生成,且差异具显著统计学意义(P<0.01)；补肾通络方含药血浆和福辛普利能下调由白介素介导的GMCs增殖,下调GMCs中TGF-β1和CTGF基因mRNA表达量,降低GMCs中TIEG1、 TGF-β1和CTGF蛋白生成,与白介素组比差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；24h补肾通络方和福辛普利部分组与空白对照组之间差异有统计学意义(P<0.05)；48h补肾通络方高、中、低剂量、福辛普利各组与空白对照组间差异无统计学意义(P>0.05)；各相同时间点补肾通络方高、中、低剂量及福辛普利各组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论：1.优选得到的前处理方法稳定可行；所建立的目标物质HPLC方法准确,灵敏度高,专属性强,可用于补肾通络方稠浸膏中以上三组分的质量控制。2.应用自制大鼠固定装置进行大鼠采血,血量多、安全性好,是一种理想的大鼠断尾采血固定新装置。所建立的血药浓度测定方法操作简便,灵敏,准确,适用于大鼠灌胃补肾通络方后血浆中马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷的同时测定；药代动力学研究结果表明,灌胃补肾通络方后马钱苷、阿魏酸和二苯乙烯苷药动学曲线均符合血管外给药二室模型,且三种成分吸收快,马钱苷和二苯乙烯苷消除速度中等,阿魏酸消除慢(但生物利用度为最高),一天给药3次能维持血药浓度,可制成普通口服制剂。3.补肾通络方能改善由炎症因子白介素所介导的大鼠肾小球系膜细胞的增殖,下调GMCs中TGF-β1和CTGF基因mRNA表达量,下调TIEG1、TGF-β1和CTGF蛋白生成,且药效呈时间和剂量依赖性。研究结果提示肾小球系膜细胞增殖与IL-1、TGF-β1、CTGF和TIEG1细胞因子密切相关；抑制TGF-β1/CTGF信号通路,调节GMCs的功能为补肾通络方临床治疗肾病综合征(Nephrotic syndrome,NS)及其衍生疾病的可能作用机制,抗TGF-β1和CTGF治疗为中药复方有效治疗肾病的靶点。