【摘 要】
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我们首先构建了PKB的PH结构域的原核表达质粒,应用PCR方法,在PH cDNA的5端及3端引入NdeI和BamHI限制性内切酶位点,扩增了PKB的PH结构域的cDNA基因,定向插入到pET19b大肠杆菌
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我们首先构建了PKB的PH结构域的原核表达质粒,应用PCR方法,在PH cDNA的5端及3端引入NdeI和BamHI限制性内切酶位点,扩增了PKB的PH结构域的cDNA基因,定向插入到pET19b大肠杆菌表达质粒T7启动子下游的多克隆区,扩增的PH片段经测序验证后,用CaCl<,2>方法转化BL21-Coden Plus大肠杆菌.SDS-PAGE分析表明,工程菌经IPTG诱导后能特异表达PH蛋白,表达产物以包涵体形式存在.大量的含PH结构域的包涵体蛋白,经变性和复性后成为具有天然构象的可溶性蛋白,并利用蛋白N端加入的组氨酸标签进行亲和层析及离子交换层析纯化蛋白.纯化的PH结构域具有与磷脂酰肌醇PI-4,5-P2的结合能力,证明其具有生物学活性.
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