蝙蝠蛾拟青霉虫草素高产菌株的选育及其培养条件优化

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冬虫夏草(Cordyceps sinensis)作为中国传统的中药,其市场前景广阔。蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)是冬虫夏草的共生菌,其活性成分和冬虫夏草高度相似,可以作为野生冬虫夏草的替代品,在保健药品领域也有着广泛的应用,如根据蝙蝠蛾拟青霉深层发酵得到的菌丝体生产的药品金水宝颗粒,在临床上应用广泛。而虫草素是天然核苷类抗生素,已被证实是冬虫夏草活性成分之一,并且其在多种疾病的治疗中发挥着不可或缺的作用。虫草素是蝙蝠蛾拟青霉的主要活性成分,虫草素含量的提高有利于增强蝙蝠蛾拟青霉发酵菌粉的市场竞争力。本文从野生冬虫夏草菌虫复合体中分离得到了一株能够产虫草素的蝙蝠蛾拟青霉菌株,并以该菌株作为出发菌株进行诱变选育及发酵条件的优化,提高了菌丝体产量和虫草素含量。主要研究结果如下:首先,从青海玉树采集野生冬虫夏草菌虫复合体进行共生菌的分离鉴定。得到的一株蝙蝠蛾拟青霉菌株(OR-1),对其进行形态学鉴定,包括单菌落观察、光学显微镜观察和扫描电镜(SEM)观察;生理生化鉴定以及18S rDNA分子鉴定,并构建了系统进化树。对蝙蝠蛾拟青霉OR-1的深层发酵进行实时监测,发酵5 d后蝙蝠蛾拟青霉菌丝体干重为11.771 g/L,虫草素含量为0.264 mg/g(菌丝体干重)。对蝙蝠蛾拟青霉OR-1进行诱变育种研究。通过60Co-γ射线诱变、紫外诱变,得到60Co-γ射线诱变的最佳诱变剂量为600 Gy,紫外诱变的最佳照射时长为20 min。并通过60Co-γ射线辐照和紫外照射复合诱变后,得到一株性状优良的诱变菌株,编号为ZJB18001。该菌株发酵5 d后,菌丝体干重达到13.275 g/L,虫草素含量为0.608 mg/g(菌丝体干重)。最后,对突变株ZJB18001发酵培养基进行了优化,考察了发酵培养基的碳源、氮源、金属离子、前体物质添加量和添加种类等对蝙蝠蛾拟青霉ZJB18001的菌丝体干重和虫草素产量的影响。四因素三水平的响应面优化实验结果表明,以21 g/L的花生油作为碳源,10 g/L的酵母提取粉作为氮源,添加1 g/L的KH2PO4,0.5 g/L的MgSO4,4.5 mmol/L金属离子和2.5 g/L的腺苷时,蝙蝠蛾拟青霉ZJB18001发酵5 d后,菌丝体干重达到18.605 g/L,虫草素产量为0.940 mg/g(菌丝体干重)。通过本研究获得的菌株ZJB18001菌丝体干重提高了54.65%,虫草素产量提高了256.1%,经培养基优化可以获得更高的菌丝体收率和活性化合物含量,具有良好的工业化应用前景。
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