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背景肺炎链球菌是肺炎、中耳炎、脑膜炎、血流感染的常见病原菌,据估算全球每年肺炎链球菌感染约1450万例次,其中中国约170万例次。肺炎链球菌的耐药性不断升高,而且青霉素药敏MIC值在不断升高,上海市肺炎链球菌对青霉素MIC最高值在1996-1999年1μg/ml,2004-2005年4μg/ml,2008-2009年>8μg/ml,国际耐药克隆的传播对肺炎链球菌耐药性上升有着重要影响。目的通过对2011年分离的青霉素耐药肺炎链球菌(PRSP)的血清型分型和多位点序列分型(MLST),分析肺炎链球菌耐药克隆传播趋势：通过比较国际流行克隆和上海本土耐药克隆在有无抗生素选择压力下适应性差别,分析其流行的原因并推测今后可能的优势克隆。方法(一)PRSP的分子流行病学：26株青霉素耐药肺炎链球菌来自2011年SOAR肺炎链球菌耐药监测项目(上海市儿童医院22株,浙江大学附属第一医院2株,北京协和医院1株,江西省人民医院1株),均来自痰标本,符合2011年非脑膜炎分离株口服青霉素耐药标准(敏感≤0.06μ g/ml中介0.12-1μ g/ml耐药≥2μg/ml)。观察菌落形态特点及胆汁溶解试验法完成菌株再鉴定,微量稀释法复测青霉素药敏及阿莫西林药敏,用聚合酶链反应(PCR)方法进行血清型鉴定；利用PCR方法扩增肺炎链球菌的7对管家基因,将管家基因PCR产物双向测序,DNAstar软件对测序结果进行拼接后通过MLST网站在线比对,获得等位基因编号和序列型别(STs),eBURST软件分析获得克隆复合体分类及菌株间的亲缘关系。(二)肺炎链球菌耐药克隆的适应性评价：从26株PRSP(中选取的Spain23F-13株、Taiwan19F-141株、上海本土耐药株4株。阿莫西林或阿莫西林/克拉维酸是临床治疗肺炎链球菌感染常用药物,尤其是儿科在治疗呼吸道感染的常用口服药物,所以本部分研究选取阿莫西林作为评价药物选择压力用药。采用菌落计数法制作杀菌曲线(包括空白对照及1/2MIC、1MIC、2MIC、4MIC、8MIC固定药物浓度)。根据空白对照(无选择压力)及1/2MIC药物浓度(亚抑菌浓度)拟合生长曲线并计算生长动力学参数—世代时间,来评价无选择压力下及亚抑菌浓度下肺炎链球菌的适应性差异；比较抑菌药物浓度下(1-8倍MIC)达到99.9%的杀菌率的时间和抗生素浓度,评价在阿莫西林选择压力下的适应性差异。(三)体外药动学药效学(PK/PD)模拟方法评价肺炎链球菌耐药克隆适应性探索：选取Taiwan19F-14克隆ST320及ST271各1株,上海本土耐药克隆1株。进行阿莫西林肉汤溶液药物浓度检测的HPLC-MS-MS方法学建立并验证,以评价药动学模拟效果。通过PK/PD模拟绘制动态杀菌曲线,比较Ke、AAC等指标,分析在药物选择压力下肺炎链球菌的适应性差异；比较ABBC0-24h与AAC0-24h的差值评价肺炎链球菌在无抗生素选择压力下的适应性差异。结果(一)PRSP分子流行病学：26株PRSP血清型主要为19F(26.9%)、19A(23.1%)、14(15.4%)、23F(11.5%),其他6株细菌为PCR方法不能鉴定的少见血清型,因此46.2%(12/26)的PRSP菌株血清型不被PCV7疫苗覆盖。26株PRSP分属以下10个MLST序列型：ST271、ST320、ST876、ST7964、ST81、ST2971、ST243、ST7963、ST7962、和ST1464,其中ST7962、ST7963和ST7964为新发现的序列型。26株PRSP中18株分属Taiwan19F-14/CC320、Taiwan23F-15/CC242、 Spain23F-1/CC81和Netherlands15B-37/CC199等4个国际耐药克隆。此外发现一个上海本土耐药克隆(2株ST2971,4株ST7964)。(二)肺炎链球菌耐药克隆的适应性评价：在无抗生素选择压力下的世代时间平均值spain23F-1克隆(0.1096h)<Taiwan19F-14克隆(0.1225h)<上海本土耐药克隆(0.1599h)。在1/2MIC阿莫西林药物浓度下的世代时间,spain23F-1克隆平均值(0.1522h)<Taiwan19F-14克隆(0.1733h)<上海本土耐药克隆平均值(0.2198h)。在抗生素选择压力下,上海本土耐药株均在4h或6h达到99.9%杀菌率,而国际流行耐药克隆菌株在2h或4h达到99.9%杀菌率。(三)体外药动学药效学(PK/PD)模型方法评价肺炎链球菌耐药克隆适应性探索：以细菌清除速率常Ke为比较指标时,500mg po q8h给药方案的细菌清除速率常数结果显示ST2971菌株未被抑制,而ST320的Ke(0.0677/h)<ST271(0.117/h)；1000mg q8h给药方案下ST2971(0.0418/h)<ST320(0.0872/h)<ST271(0.0890/h)。以AAC0-24h为比较指标,AAC0-24h值在两种给药方式下3株菌该指标比较结果均是：ST271>ST320>ST2971。以ABBC0-24h与AAC0-24h的差值比较不加药情况下菌株的生长能力,ST320>ST2971>ST271。结论1.克隆传播在肺炎链球菌耐药性上升中起重要作用,在传播的过程中耐药克隆在不断重组演变。19A血清型呈现增多趋势,青霉素耐药肺炎链球菌中19A血清型比例较高,今后我国采用的肺炎链球菌疫苗应考虑覆盖19A血清型。2.spain23F-1克隆、Taiwan19F-14克隆和上海本土耐药克隆菌株在无抗生素选择压力下和阿莫西林亚抑菌浓度(1/2MIC)药物选择压力下适应性均依次降低。在2MIC浓度的阿莫西林选择压力下,上海本土耐药克隆适应性优于spain23F-1克隆、Taiwan19F-14克隆,提示上海本土耐药克隆的流行是在抗菌药物选择压力下获得了生长优势。3.本研究建立了体外PK/PD模型,分别模拟阿莫西林口服500mg q8h和1000mgq8h给药时中国人群血药浓度变化,比较2种给药方案选择压力下Taiwan19F-14克隆(ST320、ST271)菌株和上海本土耐药克隆(ST2971)菌株的适应性。以细菌清除速率和AAC0-24h值2个指标评价,在阿莫西林2种口服给药方案选择压力下,上海本土耐药克隆株的适应性好于Taiwan1gF-14克隆,在Taiwan19F-14克隆中ST320适应性好于其单突变体ST271。在阿莫西林口服500mg q8h给药时2个克隆3株细菌的T>MIC均小于30%；阿莫西林口服1000mg q8h给药时Taiwan19F-14克隆2株细菌的T>MIC可接近40%,但上海本土耐药克隆(ST2971)菌株仍小于20%。为抑制Taiwan19F-14克隆传播,阿莫西林口服给药应采取1000mgq8h给药的大剂量给药方案。4.上海本土耐药克隆均分离自儿童,对青霉素耐药程度高(MIC值4～12μg／m1),阿莫西林口服500mg q8h和1000mg q8h2种给药方案选择压力下适应性优于国际流行克隆spain23F-1和Taiwan19F-14,血清型均属于少见型,暨有各类多糖和结合疫苗不能保护的血清型。因此在抗菌药物和多价疫苗双重选择压力下极可能获得传播优势,今后应对其密切监控。