原发性肝癌(主要为肝细胞癌,以下简称肝癌)是全球发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤之一,其发病率居第五位,病死率居第三位。在我国每年新诊断的肝癌约占全世界的55%,其死亡率在我国恶性肿瘤中位列第二位。随着诊断技术及治疗手段的进步,近二十年来疗效已经有了一定的提高,但肝癌的转移复发仍是影响长期疗效的重要阻碍。因此深入研究肝癌转移复发机制、探索有效预测肿瘤复发的分子标志物和积极抗复发治疗措施也是当前肝癌诊治中的重点和难点。炎症已经被认为是肿瘤的第七大特征,在过去的20年的研究里,关于肿瘤相关性炎症的研究如火如荼,大家已经发现肿瘤相关性炎症和肿瘤的发生,发展密切相关,影响了肿瘤的生长,侵袭和转移。原发性肝癌一般是认为经历肝炎-肝硬化发展而来,尤其亚洲感染HBV或者西欧国家感染HCV的病人容易发展成为肝癌,这些提示了炎症在肝癌的发生发展中可能起重要作用。因此,深入研究肝癌相关的炎症微环境对于肝癌的诊疗及预测预后有极大的价值。趋化因子和趋化因子受体是炎症微环境的重要组成部分,影响了肿瘤的增殖,侵袭和转移。趋化因子和受体通过自分泌或旁分泌途径参与肿瘤的发生发展,这些途径包括：白细胞的趋化和功能,细胞致敏,细胞的增殖和生长,侵袭和转移。最近,CXCL5作为一类小分子促炎的趋化因子,引起了学者们的关注,很多研究发现了CXCL5对肿瘤的生长,侵袭和转移有着重要的作用。和其他CXC类趋化因子一样,CXCL5和受体CXCR2结合,是一种促血管生成的作用的趋化因子,对中性粒细胞也有着趋化作用。CXCL5在多种肿瘤中高表达,包括：胃癌,前列腺癌,子宫内膜癌,鳞状上皮癌和前列腺癌等。CXCL5的高表达和肿瘤的进展,原位的侵袭和远处的转移密切相关。但是,CXCL5在肝癌中的作用以及与肿瘤相关性炎症还仍未知。本课题首先检测了CXCL5在不同转移潜能的肝癌细胞中的表达,通过干扰和过表达CXCL5探讨了该趋化因子在肝癌生长和转移,上皮-间质转换,以及与炎症微环境的关系。然后通过肝癌临床样本验证了上述结果。最后,我们在肝内胆管细胞癌里进一步研究了CXCL5的作用。第一部分CXCL5趋化中性粒细胞浸润,促进肝细胞癌的转移和复发目的：探讨CXCL5对肝细胞癌生物学特性,微环境及预后的作用和机制。方法：应用qRT-PCR, western blot,免疫荧光,及免疫组化检测CXCL5在正常肝细胞LO-2,不同转移潜能的肝癌细胞及包含919例肝癌患者的3组独立样本组织芯片中的表达。通过慢病毒载体介导的干扰和过表达分析CXCL5对肝癌细胞生物学特性及相关信号通路的影响。通过分离肝癌患者外周血的中性粒细胞,研究CXCL5在体外趋化中性粒细胞的作用,联合磷酸化蛋白芯片,挖掘相关分子机制。应用体内裸鼠成瘤实验,进一步探讨CXCL5对肝癌生长,转移及中性粒细胞的影响。组织芯片检测分析CXCL5的表达和中性粒细胞浸润的关系,并分析他们在预测肝癌患者预后中的作用。结果：相比于正常肝细胞,CXCL5在肝癌细胞里高表达,且随着肝癌细胞侵袭力的增加呈显著升高趋势。干扰CXCL5抑制了肝癌细胞的增殖,迁移和侵袭能力,而过表达CXCL5则提高了肝癌细胞的增殖,迁移和侵袭能力,信号通路分析显示CXCL5可以激活肝癌细胞的PI3K-Akt及ERK1/2-MAPK信号通路。体外趋化实验证实CXCL5呈剂量相关性的提高了中性粒细胞的趋化能力。在荷瘤小鼠实验中,CXCL5可以促进肝癌的生长,转移及癌内的中性粒细胞的浸润。临床组织样本检测结果表明CXCL5在癌内高表达,尤其是在复发的病人的肿瘤组织中,相关性分析显示CXCL5的表达和癌内中性粒细胞的浸润呈显著相关性,CXCL5,中性粒细胞或者联合2者均是预测肝细胞癌病人术后的独立预后因素。结论：CXCL5促进了肝癌的生长,转移及中性粒细胞浸润,CXCL5或者联合中性粒细胞可以预测肝癌病人的预后。第二部分CXCL5/CXCR2轴通过激活PI3K/Akt/GSK-3β/Snail信号通路促进肝细胞癌发生上皮-间质转化目的：研究CXCL5/CXCR2轴通过诱导肝癌细胞发生上皮-间质转化(EMT),促进肝细胞癌侵袭和转移的机制。方法：通过慢病毒介导的过表达和干扰CXCL5联合CXCR2敲减处理肝癌细胞系HepG2 和 HCCLM3,观察CXCL5和受体CXCR2在肝癌细胞侵袭和转移过程中的作用。采用qRT-PCR,WB,免疫荧光,免疫组化的方法检测EMT指标E-cadherin 和 Vimentin,明确CXCL5/CXCR2轴在介导肝癌细胞发生EMT过程中的作用。通过信号通路筛选及转录因子干扰,确定参与CXCL5/CXCR2轴介导肝癌细胞发生EMT的主要信号通路。最后在3组独立样本包含1293例肝癌病人肿瘤组织的组织芯片(TMAs)中验证上述结果,并分析CXCL5,CXCR2,EMT指标及相关信号分子与病人临床病理特征和预后的关系。结果：CXCL5/CXCR2共同促进肝癌细胞的侵袭和转移。同时高表达CXCL5和CXCR2可以促进肝癌细胞发生EMT。信号通路研究表明CXCL5/CXCR2轴通过激活P13K/Akt/GSK-3β/Snail通路促进肝细胞癌发生EMT。在肝癌样本中,CXCL5和CXCR2同时高表达和PI3K/Akt/GSK-3β/Snail通路的激活以及EMT表型显著相关,并且提示肝癌患者预后不良。结论：CXCL5/CXCR2轴通过激活P13K/Akt/GSK-3β/Snail通路促进肝细胞癌发生EMT和转移。CXCL5/CXCR2轴以及PI3K/Akt/GSK-3β/Snail通路可以预测肝癌患者的预后并可以作为潜在的治疗靶点。第三部分CXCL5在肝内胆管细胞癌中的作用和机制研究目的：探讨CXCL5对肝内胆管细胞癌(ICC)生物学特性及预后的影响和机制。方法：应用qRT-PCR,western blot,ELISA,及免疫组化检测CXCL5在正常胆管细胞和3种ICC细胞及2组独立样本的包含200例ICC病人中的表达。使用慢病毒载体介导的干扰和过表达分析CXCL5对ICC生物学特性的影响。通过分离ICC患者外周血的中性粒细胞,研究CXCL5在体外趋化中性粒细胞的作用,联合磷酸化蛋白芯片,挖掘相关分子机制。通过体内裸鼠成瘤实验,进一步探讨CXCL5对ICC生长,转移及微环境的影响。组织芯片检测分析CXCL5的表达和中性粒细胞浸润的关系,并分析他们和预后的关系。结果：相比于正常胆管细胞,CXCL5在ICC细胞里高表达。干扰或过表达CXCL5对ICC细胞的增殖,迁移和侵袭能力无显著影响。体外趋化实验证实CXCL5呈剂量相关性的提高了中性粒细胞的趋化能力,并且中性粒细胞的培养上清可以促进ICC细胞的增殖,迁移和侵袭能力。在荷瘤小鼠实验中,CXCL5可以促进ICC的生长,转移及癌内的中性粒细胞的浸润；而去除中性粒细胞则可以完全解除CXCL5对ICC的促生长和转移作用。临床组织样本检测结果表明CXCL5在癌内高表达,尤其是在复发的病人的肿瘤组织中,相关性分析显示CXCL5的表达和癌内中性粒细胞的浸润呈显著相关性,CXCL5,中性粒细胞或者联合2者均是预测ICC病人预后的独立预测指标。结论：CXCL5通过“招募”中性粒细胞癌内浸润促进了ICC的生长和转移,CXCL5或者联合中性粒细胞可以预测ICC病人的预后。结论1.CXCL5激活了肝癌细胞的PI3K-Akt和ERK1/2通路,促进了肝癌细胞的增殖,迁移和侵袭。2.CXCL5激活中性粒细胞的PI3K-Akt和p65通路,趋化中性粒细胞癌内浸润。3.CXCL5或者联合CXCL5和中性粒细胞是预测肝癌病人预后的独立预测指标。4. CXCL5/CXCR2轴通过激活PI3K/Akt/GSK-3β/Snail通路介导肝癌细胞发生EMT,促进肝癌侵袭和转移。5.在肝内胆管细胞癌中,CXCL5对胆管癌细胞无显著影响,CXCL5促进胆管细胞癌的生长和转移是通过“招募”中性粒细胞来实现的。创新点1.首次发现并报道了CXCL5在肝癌侵袭,转移及炎症微环境方面的作用。2.首次发现并报道了CXCL5/CXCR2轴通过激活PI3K/Akt/GSK-3β/Snail通路介导肝癌细胞发生EMT。3.首次发现并报道了CXCL5在肝内胆管细胞癌中的作用。潜在应用价值1.该研究有助于揭示趋化因子在肝癌转移和复发以及微环境中的作用。2.CXCL5和中性粒细胞是预测肝癌患者预后的独立预测指标,可用于临床筛选高危复发患者和指导术后治疗。3.阻断CXCL5/CXCR2轴介导的PI3K/Akt/GSK-3β/Snail可以抑制肝癌细胞发生EMT,为进一步提高肿瘤治疗的疗效提供了新的思路。4.去除癌内中性粒细胞可以作为治疗肝细胞肝癌和肝内胆管细胞癌的新的治疗手段。