研究背景：口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤,发病率占全身肿瘤的第六位,每年累及超过300,000人,五年生存率不超过50%。在美国,每年有超过35,000人被新诊断为口腔癌,在2008年就曾报道接近8,000人死于口腔癌。其恶性程度高,预后差,发病机制尚不清楚。口腔癌在早期多仅表现为黏膜改变,例如溃疡,白斑,红斑等,病变面积小与其他黏膜疾病难以区分,而当症状真正引起病人注意时往往为时已晚。因此,延迟的诊断和治疗是口腔癌的诊断率和存活率不能提高的主要原因。约60%的口腔癌被发现时已是晚期,约90%的口腔癌为鳞状上皮细胞癌,且近年来有年轻化的趋势。另一方面,相对于肝癌、肺癌等深部肿瘤,口腔癌位置表浅,因此及时发现和治疗的可行性高。早期发现、早期诊断、早期治疗癌前病变是目前降低口腔鳞癌病死率的惟一途径。对此,本课题组致力于发现新的癌症筛查方式,改善其生活质量及生存率。杜格非曾研究了孟加拉红(Rose bengal, RB)染色对于口腔癌的筛查效果,通过病损部位涂布孟加拉红,其诊断敏感性和特异性可达93.9%和73.7%,但RB对部分炎症染色与癌症染色难于区分。我组合作成员王佳宏等人通过螯合RB与纳米金棒合成新材料,利用敏感的光学检测提出新的口腔癌诊断思路,通过纳米金棒的红移现象,暗场成像等高新技术实现口腔癌细胞与正常上皮细胞的甄别,但仅为实验室研究,同时临床运用需要多种精密光学仪器,费用昂贵。在此基础上,本课题结合前人筛查方法临床要求的快捷简便及光学诊断的灵敏等优势,旨在建立诊断效率更高且更具有临床运用价值的口腔癌早期筛查系统早期检测口腔癌,并通过探究口腔黏膜恶性改变机制,希望在减缓或遏制其恶性化转变的同时,为以后寻找合适的口腔癌诊断的靶向分子打好基础,最终能通过靶向分子的特异性诊断提高诊断效率,进一步提高口腔癌生存率。活检是癌症临床诊断的金标准,通过切取病变组织后由病理学家观察微观细胞形态改变得出诊断,因此需要经验丰富的病理专家,主观性强。此外活检具有一定的侵入性,然而只有2%左右的黏膜改变可能转化为癌症,反复操作易对患者造成较大损伤,所以为了减少患者不必要的痛苦,我们希望能利用表面增强拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering, SERS)实现少量组织或细胞拉曼信号收集,完成活检前的筛查工作。而早期研究中,拉曼己经被成功用于肾癌,肝癌,肺癌,宫颈癌等各种癌症的诊断。研究结果显示对活检切除的组织进行拉曼检测,分析光谱数据后发现拉曼可很好的区分正常,炎症,癌前及癌症组织。但是生物样本的拉曼信号通常较弱,需要大块的活检组织,而相对于活检来说拉曼检测仍然是不必要的,因此拉曼检测在临床的运用受到一定的限制。随着科学研究发展,SERS利用纳米金属颗粒的SPR效应放大拉曼信号,仅仅需要收集少量细胞即可完成高敏筛查,再次使拉曼成为研究热点。早在单分子检测应用中,SERS技术即可达到超高的分辨率,可完成超低浓度溶液或者超薄薄膜中分子的检测。有研究人员报道能够达到非常可观的,即1014～1015的增强效果。因此近几年,SERS技术引起了各领域相关科研人员的极大兴趣。在生物化学领域,SERS光谱能够反映蛋白质、核酸等生物大分子的结构和构象等信息,有助于揭示生命的奥秘。在医学研究领域,SERS技术最大的特点就是无损,因此在水溶液样品的分析和选择性激发等方面具有得天独厚的优势。Sequaris等首次报道了用SERS技术表征铂的配合物与DNA的相互作用,此后很多科研小组都表示出浓厚的兴趣,相继开始了这方面的研究。研究者发现SERS可成功实现灵敏的检测出基因变异,超敏检测蛋白及RNA等。同时通过特异性分子标记后,靶向检测特定蛋白,DNA, RNA等也已成功实现,但是临床实践还有待进一步研究。同时有学者通过SERS探针实现了动物活体及活细胞的生物成像,完成生物过程的可视化。因此本实验第一个部分利用表面等离子纳米贵金属材料SERS效应来完成口腔癌的筛查。口腔癌病变多表现为黏膜改变,与其他黏膜疾病难于区分,同时容易被忽略,另一方面口腔癌位置表浅,通过脱落细胞技术可以方便收集少量的细胞样品,然后利用SERS的放大效应及拉曼检查的快速无损性等特点,发明一种新的简便的具有临床意义的癌症筛查系统。本实验第二个部分用于探究自噬在口腔癌发生发展中的早期变化。自噬是一种生物长期进化保留下来的生物过程,用于长寿命蛋白质及溶酶体,内质网等细胞器成分的降解与循环再利用,是真核细胞特有的生命现象。现已有大量研究表明自噬在多种癌症发生发展中,例如肝癌,皮肤癌,胃癌等,中起到了重要作用。然而,其结果具有一定的矛盾性。在不同的刺激因素下,例如活性氧刺激自噬产生,抑制细胞增殖进而抑制肿瘤生长。Beclin1,是自噬前体形成的重要蛋白,能与Vps34,Vps15互相结合形成自噬前体。而抑制Beclin1蛋白可促进肿瘤的发生发展。同时自噬是区别于凋亡,坏死等的一种程序性死亡过程,因而可以认为是肿瘤细胞死亡的过程。然而,在某些情况下自噬能促进肿瘤发展。一旦肿瘤形成,自噬可作为一种自我保护机制,为肿瘤生长提供能量,并抵抗放化疗疗效。因此,我们推断,自噬对于肿瘤的功能影响可能是源于不同的条件。肿瘤种类不同及阶段不同,自噬所起的作用都不尽相同。自噬相关蛋白在癌症中可表现为低表达或过度表达,其介导的损伤缓解抑制肿瘤在癌前状态,同时在特定的状态下促进肿瘤存活,有学者发现其表达与肿瘤预后及分期可能具有相关性。而口腔癌相关研究结果显示约2-12%的口腔癌癌前病变(oral premalignant lesions, OPLs)发展为癌变,80%的口腔癌源于OPLs,但是有90%左右的OPLs不会恶变为癌症,长期表现为红白斑及口腔扁平苔藓,因此对口腔癌前病变恶性转化可能性的判断,可有效减轻患者心理压力,改善生活质量,但是自噬相关水平与口腔癌恶性程度转化可能性是否相关?目前己知自噬对癌症病人分层意义重大,但对口腔癌自噬的研究较为稀缺,无法确定自噬在口腔癌中的表达高低与口腔癌预后等的关系等。所以,我们通过一个口腔癌发生发展模型来调查自噬的变化,并了解其在口腔癌早期恶性病变过程中的作用机制作为前期研究。后期仍需要更大量的实验来完成自噬特异性分子的筛选,从而实现靶向SERS的口腔癌筛查。实验第一部分利用等离子纳米颗粒,实现无适配子的SERS口腔癌筛查,在小样本研究中对正常脱落细胞和癌症脱落细胞的区分显示较好灵敏度和特异性,但是针对癌症与炎症,癌前病变的甄别,针对恶性转变几率小和恶性转变可能性大黏膜病损的甄别等更具有临床意义,其重复性仍需要进一步检验。而自噬检测在病人分层中具有重大意义,与癌症预后复发率等关系莫大,可能实现目标。而口腔癌自噬相关研究较少。因此,我们希望能够通过对口腔癌机制初探,为后期合适的癌症筛查标记筛选打好基础。最后,仍然需要大量的工作实行通过标记物与SERS的结合,利用SERS量化测量自噬水平,达到更好的筛查效果。第一部分：一种基于SERS的非侵袭性等离子癌症筛查方法背景：SERS可以实现单分子水平的测量,因此可被运用于癌症筛查。目的：利用SERS完成癌症筛查,检测该筛查方法的诊断灵敏度。方法：利用纳米贵金属颗粒表面等离子共振效应形成SERS,通过细胞脱落技术采集少量病变细胞,然后制作表面等离子基底,并利用SERS效应放大细胞信号,然后通过信号分析来筛查癌症。而拉曼散射增强基底的制作是通过浸泡的方式及静电结合原理,将纳米金棒吸附到滤纸上面,形成可弯曲的三维的异质性拉曼基底。结果：正常细胞与癌症细胞SERS光谱存在差异,揭示了癌症特定生物分子的变化,包括癌细胞增加的核酸和蛋白质以及减少的脂质。为了区分20例正常脱落细胞和癌脱落细胞,峰值比算法I16001440, I14401340(1600和1440cm-1峰位峰值比,1440和1340cm-1峰位的峰值比)诊断灵敏度和特异性可达100%,而I14401340(1440和1340cm-1峰位峰值比)仅达到70%的灵敏度和60%的特异性。结论：此方法操作简便,迅速,经济实惠,安全性高,诊断效率高,且具有非侵袭性,具有一定的临床运用前景。同时此方法可以通过计算机分析进行自动化诊断,运用范围广泛,可能运用于全身各表皮癌症的筛查,因此可成为临床上癌症筛查及诊断很好的辅助手段。第二部分：自噬与口腔癌发生的关系目的：观察自噬在口腔癌发生发展中的变化,研究其在口腔上皮恶性改变发生发展中可能的作用及调控机制。方法：建立从健康上皮到口腔鳞状细胞癌发生发展模型,在仓鼠左侧颊囊涂布0.5%DMBA,分别在4周,8周,10周,13周时处死。通过免疫组化,免疫荧光及western blot的方法来观察LC3,Beclin1,Bcl-2三个指标的表达。通过8-oHdG免疫组化结果来评估DNA损伤。结果：LC-3与Beclin1在4周时表达增加明显(p<0.05),但是在8周,10周,13周开始逐步减少。而Bcl-2表达持续增加,在13周时表达最多。而免疫荧光显示Bcl-2与Beclin1的共定位在4周迅速达到高峰,而后逐步减少。同时8-OhdG在4周时表达增加较少,而在8周,10周,12周迅速增加。结论：自噬在癌症发生发展中可能通过消除DNA损伤的方式来抑制癌症发展,但是随着刺激的持续增加,自噬清除DNA损伤的能力逐步下降,而自噬的耗竭可能加速上皮的恶变,因此可以通过对自噬的量化判断其恶性转化可能性。而自噬可能的调控机制可能受Beclin1与Bcl-2的共定位调节。