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目的:(1)本实验旨在研究毛冬青甲素对人红白血病K562细胞的增殖抑制的影响及其能否诱导K562细胞发生自噬及凋亡。(2)以LC3通路为切入点探讨毛冬青甲素抑制K562细胞增殖、诱导自噬及凋亡可能存在的作用机制。从而确定毛冬青甲素抗白血病的作用靶点和机制,为明确中药抗白血病疗效机制和中药治疗白血病提供实验室依据。方法:采用M T T方法检测毛冬青甲素对K562细胞增殖抑制的影响;透射显微镜观察毛冬青甲素作用前后K562细胞形态和细胞内的自噬体结构;采用流式细胞仪检测毛冬青甲素对K562细胞的凋亡率和LC3表达的影响;采用Western blot法检测毛冬青甲素作用后自噬相关蛋白LC3的表达变化。结果:1.MTT法检测毛冬青甲素对K562细胞增殖抑制的影响结果示:与空白对照组比较,实验组K562的增殖抑制率明显升高(P<0.05)。与低浓度组(10、20ug/mL)相比较,高浓度组(40、80、100μg/ml)对K562细胞抑制率明显增高(P<0.05)。随着培养时间的延长,实验组K562细胞的增殖抑制率明显增高,差异显著(P<0.05)。毛冬青甲素对K562细胞有明显的增殖抑制作用,且抑制增殖的作用与时间呈正相关,表现为剂量依赖性。2.透射显微镜观察细胞形态:K562细胞被毛冬青甲素干预48h后,电镜下观察到实验组K562细胞部分细胞胞膜不完整,染色质固缩,密度增加,部分染色质破裂,散布在胞浆之内,凝结成块,染色不均匀。K562细胞的凋亡数量随着药物溶度增加而增多。对照组K562细胞形态基本正常。3.MDC染色后荧光显微镜下观察示:与对照组细胞相比,实验组细胞内可见较多荧光颗粒且表现为更强的荧光。将含绿色荧光颗粒和绿色强荧光的细胞记为M D C阳性细胞,将实验组与对照组的MDC阳性率相比较,实验组的MDC阳性率增高显著,有明显差异(P<0.05)。浓度不同两组间比较,MDC阳性率无明显差异(P>0.05)。4.流式细胞仪检测毛冬青甲素对K562细胞的凋亡率和LC3表达的影响示:毛冬青甲素(0、20、40μg/ml)作用于K562细胞48h后细胞的凋亡率分别为:4.52±1.98%,14.98±2.63%,38.45±1.64%。与对照组比较,实验组K562细胞凋亡率明显增高(P<0.05)。浓度不同组间相比较,高浓度组的细胞凋亡率明显高于低浓度组,差异显著(P<0.05),毛冬青具有明显促进K562细胞凋亡的作用,并呈剂量依赖性。药物作用后LC3阳性表达率分别为:8.74±0.75,27.62±1.49,40.89±1.27。实验组的LC3阳性表达率明显高于对照组,差异显著(P<0.05)。高浓度组的LC3阳性表达率明显高于低浓度组,差异显著(P<0.05)。提示,毛冬青甲素能上调对K562细胞LC3表达,其阳性表达率与药物浓度呈正相关。5.Western blot法检测毛冬青甲素对K562细胞LC3蛋白表达的影响示:用不同浓度毛冬青甲素干预K562细胞48h后,随着药物浓度的增加自噬相关蛋白L C 3Ⅰ/Ⅱ的表达逐步上调。说明毛冬青甲素可以通过上调LC3的表达有效诱导K562细胞自噬及凋亡,且呈剂量依赖性。与对照组比较,实验组LC3Ⅰ/Ⅱ表达均明显增加(P<0.05)。与低浓度组比较,毛冬青甲素高浓度组LC3Ⅰ/Ⅱ表达明显上调,差异显著(P<0.05)。毛冬青甲素高浓度组内K562细胞L C 3-Ⅰ与LC3-Ⅱ表达无明显差异(P>0.05)。结论:1.毛冬青甲素可以影响人白血病K562细胞的增殖抑制。2.毛冬青甲素可以诱导人白血病K562细胞发生自噬和凋亡。3.毛冬青甲素可能是通过上调自噬相关蛋白LC3的表达从而诱导K562细胞自噬,从而抑制了K562细胞的增殖活力。4.毛冬青甲素抑制K562细胞增殖效应和诱导K562细胞自噬呈时间和剂量依赖趋势。