G-蛋白偶联受体(GPCR)是最大家族的膜蛋白,具有七次跨膜结构,调控着人体各种生命活动且与疾病密切相关,约有一半的药物作用在GPCR上。但是至今B类GPCR非肽类激动剂药物一个也没有,这是由于B类GPCR与激动剂的复合晶体结构的缺失,极大地限制了对B类GPCR结构与功能关系及其在人类重大疾病中调控机制的认识。关于天然的多肽如何与B类GPCR的N端ECD和跨膜区域TMD进行结合从而激活受体这一问题也不清楚。为了探讨B类GPCR的ECD和TMD如何与配体进行识别结合的作用机制,通过cAMP检测不同的B类GPCR的TMD和全长的受体的激活效用。结果显示不同的B类受体对ECD需求截然不同,一组以CRF1R,PACIR及PTHIR为代表,它们对ECD的要求是可以忽略的；相反另一组以GCGR和GLP-1R为代表,它们的活性严格依赖于他们的ECD。进一步用锚定在膜上的多肽与受体共转,也只能激活全长的GLP-1R或GCGR,不能激活TMD,进一步表明ECD在受体激活下游信号通路中的重要性。再次证实ECD对GLP-1R和GCGR激动效应是必需的。用配体受体融合蛋白进一步研究GCGR和GLP-1R激活时必需有ECD的机制。通过ECD和多肽上的点突变,发现GCGR的ECD与配体结合的3个重要位点,W36,D63,P86,突变后融合蛋白自身活性明显下降,且外源的多肽也不能使其活性恢复,表明这些位点与多肽直接结合密切相关。此外ECD表面和多肽上的一些突变也能引起融合蛋白活性明显降低,GLP-1R的融合蛋白中也得到了相似结果,提示我们ECD在GLP-1R和GCGR激活中不仅有亲和多肽的作用,且与ECD有直接的结合作用。为研究2型糖尿病预防和治疗的分子机制以及为新药设计和研发提供实验根据,通过cAMP实验表明GLP-1R的小分子激动剂Boc5、S4P、WB4-24不仅具有物种选择性,直接结合ECD,且需要ECD才能激活GLP-1R下游信号通路。相反BETP不直接结合ECD,与第三个胞内环的C347共价结合激活GLP-1R,但同样需要ECD才能激活受体,提示我们ECD在GLP-1R激活效用中所起的直接作用。这些化合物的研究将为小分子与受体的相互作用机制提供新的思路,为设计新的小分子化和物治疗糖尿病提供可能。GLP-1R是抗糖尿病相关的靶标蛋白,稳定性差,导致全长的GLP-1R的结晶难度极大。在昆虫细胞表达系统和哺乳细胞BacMam表达系统中通过基因改造、载体和纯化条件优化使其蛋白稳定、利于结晶。得到了性状较好的激活的融合蛋白,为结晶工作及解析配体与受体复合物激活构象做好充分准备。将为B类GPCR激活状态下配体与受体结合作用模式提供一个直接的构象依据,为2型糖尿病新药开发提供结构基础,具有不可估量的应用价值。